本文關(guān)鍵詞：人去乙�；窼IRT1的基因克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)　出處：《鄭州大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：Sirtuin家族在生命體中廣泛存在，是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的III類組蛋白去乙酰化酶，迄今為止在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的sirtuin家族成員有SIRT1~SIRT7，其中對SIRT1的研究最為廣泛。在SIRT1介導(dǎo)的去乙酰化反應(yīng)中，NAD+以共同底物的角色參與反應(yīng)，該反應(yīng)過程主要是在SIRT1的催化作用下將作用底物中的乙�；D(zhuǎn)移到NAD+的ADP核糖基上，最終產(chǎn)物包括去乙�；蟮腟IRT1底物，，以及煙酰胺（NAM）和O-乙酰基-ADP-核糖。SIRT1的作用底物不僅有組蛋白底物，還有一部分非組蛋白底物，通過對這些底物的去乙酰化作用，SIRT1參與調(diào)控了機(jī)體的眾多生理過程，例如細(xì)胞的凋亡、分化以及衰老，基因的表達(dá)調(diào)控、能量代謝等。同時SIRT1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的聯(lián)系，但是其主要的作用仍存在著爭議，這主要是因?yàn)樵诎┌Y中SIRT1究竟扮演著促癌因子還是抑癌因子的角色尚不能成定論，且在不同的腫瘤組織中其表達(dá)水平不夠統(tǒng)一。盡管如此，SIRT1作為一個潛在的藥物靶點(diǎn)，已經(jīng)得到了越來越多的科學(xué)家的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室擬采用基因工程的方法制備具有高生物活性和特異性的SIRT1重組蛋白，并對體外篩選SIRT1激動劑與抑制劑奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研對人SIRT1蛋白選取其193-747位氨基酸片段作為活性片段，因所得cDNA的不正確性，采用Overlap PCR的方法對其進(jìn)行了定點(diǎn)突變，獲得了序列完全正確的活性片段，并將該片段克隆于pGEM-T Easy克隆載體中。鑒定正確之后，將正確的活性片段的基因片段連接入表達(dá)載體pET28b中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28b/SIRT1。將得到的重組表達(dá)載體pET28b/SIRT1轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，加入IPTG后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。提取蛋白后，經(jīng)鎳柱親和層析純化后得到目的蛋白。 成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b/SIRT1，并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)。重組蛋白以可溶蛋白形式表達(dá)，確定誘導(dǎo)表達(dá)的條件為：重組表達(dá)宿主菌37℃振搖培養(yǎng)至OD600約為0.8時加入終濃度為0.5mM的IPTG，20℃培養(yǎng)過夜。純化后可以得到電泳純度大于90%的重組蛋白。最后采用熒光定量比色法對純化后的重組蛋白進(jìn)行了活性檢測，選用共價偶聯(lián)的短肽Ac-Arg-His-Lys-Lys(Ac)-AMC作為SIRT1的去乙酰化底物，最終結(jié)果顯示未加底物組與加底物組的熒光值存在明顯的差異，證明該重組人SIRT1蛋白在外具有穩(wěn)定的去乙�；饔谩Ｇ以摶钚詸z測法可以作為SIRT1抑制劑與激活劑的篩選模型。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3416

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1307989