本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌噬菌體LSB-1裂解酶基因gp17的表達(dá)、抗菌效應(yīng)分析及優(yōu)化設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)

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【摘要】：自噬菌體被發(fā)現(xiàn)以來(lái)便廣發(fā)被用于抗菌相關(guān)研究。但是自弗萊明于1928年意外發(fā)現(xiàn)青霉素作為抗菌藥物以后，由于抗生素治療效果顯著，且噬菌體研究不夠成熟，利用噬菌體進(jìn)行抗菌一直處于擱置狀態(tài)。2001年Nelson等通過(guò)重組表達(dá)獲得了純化的噬菌體裂解酶并將其作為抗菌物質(zhì)進(jìn)行研究。近年來(lái)，，隨著耐藥菌的廣泛產(chǎn)生以及環(huán)境保護(hù)面臨嚴(yán)峻壓力，以及抗生素的研發(fā)周期遠(yuǎn)長(zhǎng)于細(xì)菌對(duì)該物質(zhì)產(chǎn)生耐藥的周期，對(duì)噬菌體抗菌功能的探索及應(yīng)用產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)逐漸成為醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)之一。噬菌體的天然抗菌效應(yīng)和通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)人工修飾的改良產(chǎn)物表現(xiàn)特色給環(huán)境凈化、水體凈化、食物安全及臨床抗菌應(yīng)用開(kāi)辟了新的發(fā)展方向。2013年歐洲還成立了PhagoBurn項(xiàng)目專門(mén)用于研究噬菌體治療燒傷后大腸桿菌和綠膿桿菌感染問(wèn)題。 噬菌體作為細(xì)菌病毒，能夠特異性識(shí)別和裂解細(xì)菌，其滅菌效應(yīng)被越來(lái)越多的研究者關(guān)注。噬菌體裂解酶作為噬菌體在進(jìn)入細(xì)菌之前溶解細(xì)胞壁以及在宿主體內(nèi)繁殖之后裂解細(xì)菌、釋放子代噬菌體的關(guān)鍵酶，現(xiàn)正受到越來(lái)越多的研究者的重視并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。 本教研室在醫(yī)院的污水池中分離到一株大腸桿菌噬菌體并將其命名為L(zhǎng)SB-1，初步研究發(fā)現(xiàn)了該噬菌體裂解細(xì)菌的相關(guān)酶基因gp17，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序后提交至GenBank（GenBank序列號(hào): KC425724.1）。本研究通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)將唾液酸酶基因克隆到質(zhì)粒pET300構(gòu)建重組質(zhì)粒pET300-gp17，然后再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，最終獲得了gp17基因表達(dá)的純化蛋白。采用KB紙片法對(duì)純化重組蛋白的有效菌譜進(jìn)行測(cè)定，并將測(cè)定結(jié)果與通過(guò)噬菌體展示技術(shù)將gp17基因重組到T7噬菌體得到的T7-LSB-gp17重組噬菌體的有效菌譜進(jìn)行比較，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析。為了進(jìn)一步提高酶活性，擬對(duì)gp17唾液酸酶的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變以增強(qiáng)其活性，并用AutoDock分子對(duì)接軟件對(duì)替換后的蛋白和唾液酸進(jìn)行對(duì)接以查看替換后蛋白和唾液酸的結(jié)合效果。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1．唾液酸酶基因的克隆、表達(dá)和純化：利用基因重組技術(shù)將EIEC8401噬菌體LSB-1裂解酶基因gp17構(gòu)建到表達(dá)載體質(zhì)粒pET300中,并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)及純化，最終獲得了gp17基因通過(guò)重組成功表達(dá)出分子量為78kDa的溶解蛋白；利用BCA法測(cè)定純化重組蛋白的含量，純化后濃度為2.38mg/ml。 2．利用抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白的抑菌活性：以大腸桿菌、葡萄球菌等多種細(xì)菌等為試驗(yàn)菌采用Kirby-Bauer紙片法對(duì)重組噬菌體唾液酸酶的有效作用菌譜進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)重組噬菌體酶對(duì)噬菌體宿主菌EIEC8401有良好的抑菌作用，經(jīng)過(guò)5小時(shí)的培養(yǎng)能夠見(jiàn)到直徑約為2cm、明顯的抑菌圈，對(duì)其他種類(lèi)的細(xì)菌無(wú)明顯抑菌作用，顯示該噬菌體酶具有高度特異性，這種特異性與T7噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)物（重組噬菌體T7-LSB-gp17較寬的宿主譜）不同。 3．采用結(jié)構(gòu)域單獨(dú)表達(dá)法與非保守位點(diǎn)突變法為理論依據(jù)設(shè)計(jì)突變體，通過(guò)AutoDock軟件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將結(jié)構(gòu)域直接進(jìn)行表達(dá)(突變體2)以及非保守位點(diǎn)124位(突變體6)和167位(突變體7)的天冬酰胺改變?yōu)榻z氨酸獲得的突變體進(jìn)行表達(dá)獲得突變體具有結(jié)合能更低、與底物結(jié)合能力更強(qiáng)。用信息技術(shù)對(duì)突變體進(jìn)行顯示了生物信息學(xué)差異。 綜上所述，本研究將噬菌體裂解細(xì)菌的唾液酸酶進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化獲得目的蛋白，進(jìn)行體外活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其對(duì)EIEC8401有較好的特異性，其結(jié)果與通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得的重組噬菌體T7-LSB-gp17有較大的差異；通過(guò)對(duì)酶的相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行突變，獲得了一系列突變株，采用AutoDock進(jìn)行對(duì)接，預(yù)測(cè)顯示將結(jié)構(gòu)域直接進(jìn)行表達(dá)(突變體2)以及非保守位點(diǎn)124位(突變體6)和167位(突變體7)的天冬酰胺改變?yōu)榻z氨酸獲得的突變體具有較原蛋白更好的結(jié)合能力，通過(guò)分析認(rèn)為其活性增加是由于其結(jié)構(gòu)改變引起的，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步研究該唾液酸酶的功能、機(jī)制等方面奠定了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R378.21

【參考文獻(xiàn)】

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