本文關(guān)鍵詞：CRISPR-Cas9敲減豬GGTA1基因的質(zhì)粒構(gòu)建

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【摘要】：目的:利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù),構(gòu)建靶向豬GGTA1基因的敲減質(zhì)粒。方法:將Lenti CRISPR-v2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α進(jìn)行擴(kuò)增并提取該質(zhì)粒,設(shè)計(jì)并合成靶向豬GGTA1基因的g RNA(guide RNA,g RNA)序列,對(duì)Lenti CRISPR-v2質(zhì)粒進(jìn)行Bsm BI酶切及電泳和膠回收,并將膠回收產(chǎn)物與g RNA序列進(jìn)行連接,構(gòu)建Lenti CRISPR-v2-g RNA重組質(zhì)粒,將該重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,培養(yǎng)過(guò)夜后,將其涂布于含有氨芐青霉素(Ampicillin,AMP)的LB固體培養(yǎng)基,篩選陽(yáng)性單克隆DH5α進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,對(duì)提取的Lenti CRISPR-v2-g RNA敲減質(zhì)粒進(jìn)行Kpn I與Eco RI雙酶切驗(yàn)證與序列測(cè)定。結(jié)果:Lenti CRISPR-v2載體酶切結(jié)果正確;目的 g RNA序列成功插入酶切后的Lenti CRISPR-v2載體且序列正確。結(jié)論:利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建靶向豬GGTA1基因的敲減質(zhì)粒,該研究為后續(xù)慢病毒的包裝及CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲減豬GGTA1基因的效率與功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 深圳市第二人民醫(yī)院;深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院深圳市馴化器官醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81200465) 深圳市“三名”工程(馴化器官)項(xiàng)目(2015)
【分類號(hào)】：R3416
【正文快照】： 異種移植是當(dāng)前解決人類供體器官不足的有效途徑,其中豬→人的異種器官移植是可能的解決途徑之一,但此方法與同種移植相比,需解決由更強(qiáng)烈更復(fù)雜的免疫排斥反應(yīng)所產(chǎn)生的問(wèn)題[1]。其中反應(yīng)較強(qiáng)烈的超急性排斥(hyperacuterejection,HAR)是異種移植研究中首要解決的問(wèn)題[2,3]。GG

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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【共引文獻(xiàn)】

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2 李紅衛(wèi);沈振亞;邱玉華;法憲恩;;阻斷共刺激信號(hào)在異種小動(dòng)物心臟移植中誘導(dǎo)免疫耐受的研究[J];醫(yī)藥論壇雜志;2010年21期

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6 馮莉,李幼平;異種移植免疫學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2002年04期

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8 王飛;馮沖;龍川;岳成鶴;王寧;李西睿;曹隨忠;李明洲;儲(chǔ)明星;潘登科;帥素容;;利用體細(xì)胞LOH突變制備α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因(GGTA1)缺失的五指山小型豬[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年04期

9 岳成鶴;曹隨忠;李西睿;馮沖;龍川;余樹(shù)民;儲(chǔ)明星;潘登科;;應(yīng)用半乳糖表型差異高效篩選α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因缺失的豬成纖維細(xì)胞[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年01期

10 楊希祥;魏靜;宋小鳳;石寧寧;馮沖;臧榮鑫;潘登科;李娟;;胰腺特異性表達(dá)載體PDX1-eGFP構(gòu)建及體外驗(yàn)證[J];畜牧與獸醫(yī);2015年03期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 楊光倫;NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑在延遲性異種移植排斥反應(yīng)中的作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2003年

2 關(guān)兆杰;抗凝治療對(duì)延遲性異種移植排斥反應(yīng)的作用[D];汕頭大學(xué);2003年

3 邱罕凡;異種心臟移植排斥反應(yīng)中黏附分子的表達(dá)及LFA-1 mAb、AS-ICAM-1 ODN的作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2003年

4 王建偉;供體源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)非協(xié)調(diào)性異種肝臟移植免疫排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];浙江大學(xué);2004年

5 唐華;Pentoxifylline聯(lián)用免疫抑制劑對(duì)小鼠→大鼠異種移植心臟存活時(shí)間的影響及其機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2005年

6 張啟旭;氣管移植的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2003年

7 王建東;恒河猴凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ的遺傳分子研究[D];四川大學(xué);2007年

8 朱勇;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)異種氣管移植免疫排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2009年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 沈賢波;B7反義硫代寡核苷酸設(shè)計(jì)、合成、以及對(duì)大鼠同種異體心臟移植的影響[D];汕頭大學(xué);2002年

2 裴夫瑜;造血干細(xì)胞嵌合體在異種骨髓移植中的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

3 郝念;角膜體外重建異種生物載體材料生物相容性研究[D];暨南大學(xué);2004年

4 陳根云;直徑10mm異種角膜基質(zhì)生物相容性及神經(jīng)再生研究[D];暨南大學(xué);2006年

5 李靜;應(yīng)用異種脫細(xì)胞真皮的眼瞼原位重建術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2007年

6 邢丹;喹賽多相關(guān)鋅指蛋白的表達(dá)調(diào)控與其調(diào)節(jié)基因的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

7 岳成鶴;GGTA1基因缺失五指山小型豬的制備[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

8 王飛;GGAT1基因敲除豬的制備及其功能驗(yàn)證[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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1 潘登科;張莉;周艷榮;馮沖;龍川;劉曉;董恩球;王樹(shù)臣;萬(wàn)榮;張健;陳紅星;;體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因sFat-1克隆豬[J];中國(guó)科學(xué)(C輯:生命科學(xué));2009年03期

2 常宏宇;宮鋒;季守平;鮑國(guó)強(qiáng);李素波;章?lián)P培;李芳;聶亞玲;;利用正負(fù)篩選打靶載體在豬腎細(xì)胞系PK-15細(xì)胞中敲除GGTA1基因[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2010年03期

3 霍金龍,羅古月,張娟,張美,曾養(yǎng)志;新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物——近交系豬的應(yīng)用前景[J];中國(guó)牧業(yè)通訊;2004年04期

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5 常宏宇;宮鋒;季守平;鮑國(guó)強(qiáng);李素波;章?lián)P培;李芳;聶亞玲;;豬α-1,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因打靶載體的構(gòu)建[J];生物技術(shù)通訊;2010年02期

6 李鴻輝;馮沖;王寧;閆軍;哈福;陳紅星;樊寶良;潘登科;;Myostatin基因打靶載體的構(gòu)建及豬胎兒成纖維細(xì)胞Myostatin基因的敲除[J];生物技術(shù)通訊;2010年05期

7 鄭道山;馮沖;朱彥賓;龍川;馮書(shū)堂;潘登科;馬文麗;;利用啟動(dòng)子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1基因[J];生物技術(shù)通訊;2011年04期

8 李幼平,馬玉奎,何秋明;臨床異種大動(dòng)物器官移植的現(xiàn)狀、問(wèn)題與對(duì)策綜述[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;1998年02期

9 李幼平,何秋明,蔡紹暉,程驚秋;異種移植與中國(guó)地方豬種資源的利用[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;1999年01期

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 常宏宇;宮鋒;季守平;鮑國(guó)強(qiáng);李素波;章?lián)P培;李芳;聶亞玲;;利用正負(fù)篩選打靶載體在豬腎細(xì)胞系PK-15細(xì)胞中敲除GGTA1基因[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2010年03期

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本文編號(hào)：1295085