本文關(guān)鍵詞：冠狀病毒木瓜樣蛋白酶誘導(dǎo)自噬生物學(xué)效應(yīng)研究

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【摘要】：背景：細(xì)胞自噬（Autophagy）是通過溶酶體介導(dǎo)降解蛋白的高度保守過程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。冠狀病毒是一類擁有龐大RNA基因組的包膜病毒。目前人類冠狀病毒包括hCoV-229E、hCoV-OC43、SARS-CoV、hCoV-NL63、 hCoV-HKU1和最近發(fā)現(xiàn)的人類新冠狀病毒hCoV-EMC六種，其中NL63、HKU1和hCoV-EMC病毒是繼SARS冠狀病毒后出現(xiàn)的人類新發(fā)冠狀病毒。NL63冠狀病毒是由荷蘭學(xué)者2004年首先報(bào)道，呈世界性分布，已成為人類呼吸道感染的主要新發(fā)病原之一。目前臨床上尚無抗冠狀病毒特效藥物和預(yù)防疫苗。自噬與病毒感染過程密切相關(guān)，已成為抗病毒藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。冠狀病毒木瓜樣蛋白酶(Papain-like protease, PLP)在冠狀病毒復(fù)制中起著重要作用。目前冠狀病毒編碼的PLP調(diào)控宿主細(xì)胞自噬及其反應(yīng)機(jī)制尚不清楚。圍繞這一問題本論文對(duì)冠狀病毒編碼的膜定位木瓜樣蛋白酶(PLP-TM)功能進(jìn)行深入的研究。 目的：以人冠狀病毒NL63為例闡述冠狀病毒與自噬的關(guān)系，，從冠狀病毒木瓜樣蛋白酶PLP角度具體研究冠狀病毒是否誘導(dǎo)自噬，進(jìn)一步拓展了冠狀病毒木瓜樣蛋白酶的功能，對(duì)闡明人類新發(fā)冠狀病毒致病機(jī)理和研發(fā)抗病毒藥物具有重要參考價(jià)值。 方法：首先，將人冠狀病毒NL63木瓜樣蛋白酶PLP與帶有綠色熒光蛋白GFP的LC3B質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，通過細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)確定NL63木瓜樣蛋白酶PLP是否引起特征性GFP-LC3B點(diǎn)狀聚集。其次，通過Western blot、免疫熒光染色技術(shù)和電子投射電鏡技術(shù)檢測PLP誘導(dǎo)自噬。進(jìn)一步對(duì)機(jī)制進(jìn)行研究，首先Western blot技術(shù)檢測自噬蛋白p62的表達(dá)；免疫熒光染色技術(shù)檢測PLP2-TM引起pmRFP-GFP-LC3綠色熒光和紅色熒光蛋白標(biāo)記點(diǎn)狀自噬體聚集情況。分子克隆技術(shù)構(gòu)建pcMV-Myc-Beclin1載體，通過免疫共沉淀技術(shù)研究PLP2-TM與Beclin1以及PLP2-TM與內(nèi)源性LC3的相互作用。Western blot檢測內(nèi)源性Beclin1表達(dá)，免疫共沉淀技術(shù)檢測PLP2-TM對(duì)Beclin1的泛素化水平影響情況。最后，通過免疫共沉淀技術(shù)檢測PLP2-TM對(duì)STING分別與Beclin1和LC3相互作用的影響。 結(jié)果：1. PLP2-TM是冠狀病毒編碼自噬誘導(dǎo)蛋白：通過免疫熒光技術(shù)研究人冠狀病毒NL63木瓜樣蛋白酶PLP與自噬的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)僅PLP2-TM可引起明顯的綠色熒光蛋白標(biāo)記自噬體聚集，而其他木瓜樣蛋白酶比如PLP1、PLP1-TM和PLP2誘導(dǎo)自噬體聚集不明顯。提示PLP2-TM具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬特性，是一種冠狀病毒編碼自噬誘導(dǎo)蛋白。 2. PLP2-TM誘導(dǎo)自噬現(xiàn)象：在HEK293T、Hela和MCF-7不同細(xì)胞中，PLP2-TM均引起綠色熒光蛋白標(biāo)記的自噬體明顯聚集，并促進(jìn)自噬標(biāo)準(zhǔn)蛋白LC3-II表達(dá)。在PLP2-TM轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長PLP2-TM誘導(dǎo)自噬體聚集更明顯，并明顯促進(jìn)LC3-II表達(dá)。電子投射電鏡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PLP2-TM實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)明顯自噬體特異性雙層膜結(jié)構(gòu)，陽性對(duì)照組細(xì)胞同樣出現(xiàn)自噬溶酶體特異性單層膜結(jié)構(gòu)，而陰性對(duì)照組細(xì)胞沒有觀察到明顯的自噬體相關(guān)膜型結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3-MA特異性抑制PLP2-TM促進(jìn)的LC3-II表達(dá)。 3. PLP2-TM誘導(dǎo)不完全自噬效應(yīng)的研究：實(shí)驗(yàn)組中PLP2-TM促進(jìn)LC3-II表達(dá)增多但對(duì)自噬底物p62蛋白穩(wěn)定性表達(dá)沒有影響，陽性對(duì)照組中Rapamycin激活LC3-II表達(dá)且促進(jìn)p62蛋白表達(dá)降低，暗示PLP2-TM誘導(dǎo)不完全自噬效應(yīng)；PLP2-TM引起pmRFP-GFP-LC3質(zhì)粒表達(dá)中綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標(biāo)記自噬體的明顯聚集，陽性對(duì)照組不完全自噬誘導(dǎo)劑CQ處理轉(zhuǎn)染pmRFP-GFP-LC3質(zhì)粒的細(xì)胞中觀察到既有綠色熒光蛋白標(biāo)記自噬體聚集又有紅色熒光蛋白標(biāo)記自噬體聚集，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染PLP2-TM與陽性對(duì)照CQ誘導(dǎo)結(jié)果一致，而陰性對(duì)照組細(xì)胞中紅色熒光蛋白標(biāo)記自噬體聚集明顯，表明PLP2-TM誘導(dǎo)不完全自噬效應(yīng)。 4. PLP2-TM誘導(dǎo)自噬機(jī)制研究：（1）PLP2-TM與LC3相互作用：PLP2-TM引起明顯的綠色熒光蛋白標(biāo)記自噬體聚集并且與綠色熒光蛋白eGFP-LC3B標(biāo)記自噬體共定位；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中顯示PLP2-TM與內(nèi)源性LC3免疫共沉淀，暗示著在冠狀病毒感染過程中冠狀病毒可以通過PLP2-TM定位于自噬體膜上為冠狀病毒復(fù)制提供場所。（2）PLP2-TM與Beclin1相互作用：成功構(gòu)建pcMV-Myc-Beclin1表達(dá)載體；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PLP2-TM分別在過表達(dá)體系和內(nèi)源性體系中與Beclin1相互作用。本研究結(jié)果提示冠狀病毒編碼的木瓜樣蛋白酶可以類似其他病毒蛋白一樣通過結(jié)合Beclin1阻斷自噬溶酶體的形成誘導(dǎo)不完全自噬效應(yīng)為病毒復(fù)制提供場所。（3） PLP2-TM通過去泛素酶活性降低Beclin1泛素化水平促進(jìn)其表達(dá)：PLP2-TM在HEK293T、Hela和MCF-7不同細(xì)胞系中促進(jìn)內(nèi)源性Beclin1表達(dá)；并且在HEK293T細(xì)胞中免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PLP2-TM明顯降低Beclin1泛素化水平，前期研究表明PLP2-TM具有DUB酶活性，暗示著PLP2-TM通過降低Beclin1的泛素化水平促進(jìn)Beclin1表達(dá)。5. PLP2-TM對(duì)STING與Beclin1相互作用的影響：在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)PLP2-TM，STING和Beclin1，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLP2-TM促進(jìn)STING與Beclin1相互作用；LC3與Beclin1同為自噬調(diào)節(jié)蛋白但PLP2-TM對(duì)STING與LC3之間作用沒有影響。本部分研究結(jié)果可能進(jìn)一步解釋PLP2-TM通過STING負(fù)調(diào)控宿主天然免疫。 結(jié)論：NL63編碼的木瓜樣蛋白酶（PLP）是一種自噬誘導(dǎo)蛋白，PLP2-TM可能通過去除Beclin1泛素化水平并且與Beclin1相互作用誘導(dǎo)不完全自噬活性；同時(shí)PLP2-TM能夠促進(jìn)STING與其誘導(dǎo)的自噬膜上關(guān)鍵分子Beclin1相互作用，提示PLP2-TM通過誘導(dǎo)的自噬體膜上Beclin1分子滯留STING，這可能阻止STING信號(hào)向下傳導(dǎo)從而負(fù)調(diào)控天然免疫反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 朱娜;譚文杰;;細(xì)胞自噬對(duì)人冠狀病毒復(fù)制與致病性的影響[J];病毒學(xué)報(bào);2010年06期

2 趙美;臧偉進(jìn);;巨自噬在心臟疾病調(diào)節(jié)中的雙向作用[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2011年02期

3 王凱;鄭洋;邢雅玲;陳曉娟;陳忠斌;;細(xì)胞自噬在病毒感染與免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2011年11期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張曉延;腸道病毒71型誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、凋亡及相互調(diào)控關(guān)系的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

本文編號(hào)：1290083