本文關鍵詞：冠狀病毒木瓜樣蛋白酶誘導自噬生物學效應研究

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【摘要】：背景：細胞自噬（Autophagy）是通過溶酶體介導降解蛋白的高度保守過程，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。冠狀病毒是一類擁有龐大RNA基因組的包膜病毒。目前人類冠狀病毒包括hCoV-229E、hCoV-OC43、SARS-CoV、hCoV-NL63、 hCoV-HKU1和最近發(fā)現(xiàn)的人類新冠狀病毒hCoV-EMC六種，其中NL63、HKU1和hCoV-EMC病毒是繼SARS冠狀病毒后出現(xiàn)的人類新發(fā)冠狀病毒。NL63冠狀病毒是由荷蘭學者2004年首先報道，呈世界性分布，已成為人類呼吸道感染的主要新發(fā)病原之一。目前臨床上尚無抗冠狀病毒特效藥物和預防疫苗。自噬與病毒感染過程密切相關，已成為抗病毒藥物研發(fā)的重要靶點。冠狀病毒木瓜樣蛋白酶(Papain-like protease, PLP)在冠狀病毒復制中起著重要作用。目前冠狀病毒編碼的PLP調(diào)控宿主細胞自噬及其反應機制尚不清楚。圍繞這一問題本論文對冠狀病毒編碼的膜定位木瓜樣蛋白酶(PLP-TM)功能進行深入的研究。 目的：以人冠狀病毒NL63為例闡述冠狀病毒與自噬的關系，，從冠狀病毒木瓜樣蛋白酶PLP角度具體研究冠狀病毒是否誘導自噬，進一步拓展了冠狀病毒木瓜樣蛋白酶的功能，對闡明人類新發(fā)冠狀病毒致病機理和研發(fā)抗病毒藥物具有重要參考價值。 方法：首先，將人冠狀病毒NL63木瓜樣蛋白酶PLP與帶有綠色熒光蛋白GFP的LC3B質粒共轉染于細胞中，通過細胞免疫熒光染色技術確定NL63木瓜樣蛋白酶PLP是否引起特征性GFP-LC3B點狀聚集。其次，通過Western blot、免疫熒光染色技術和電子投射電鏡技術檢測PLP誘導自噬。進一步對機制進行研究，首先Western blot技術檢測自噬蛋白p62的表達；免疫熒光染色技術檢測PLP2-TM引起pmRFP-GFP-LC3綠色熒光和紅色熒光蛋白標記點狀自噬體聚集情況。分子克隆技術構建pcMV-Myc-Beclin1載體，通過免疫共沉淀技術研究PLP2-TM與Beclin1以及PLP2-TM與內(nèi)源性LC3的相互作用。Western blot檢測內(nèi)源性Beclin1表達，免疫共沉淀技術檢測PLP2-TM對Beclin1的泛素化水平影響情況。最后，通過免疫共沉淀技術檢測PLP2-TM對STING分別與Beclin1和LC3相互作用的影響。 結果：1. PLP2-TM是冠狀病毒編碼自噬誘導蛋白：通過免疫熒光技術研究人冠狀病毒NL63木瓜樣蛋白酶PLP與自噬的關系，實驗發(fā)現(xiàn)僅PLP2-TM可引起明顯的綠色熒光蛋白標記自噬體聚集，而其他木瓜樣蛋白酶比如PLP1、PLP1-TM和PLP2誘導自噬體聚集不明顯。提示PLP2-TM具有誘導細胞自噬特性，是一種冠狀病毒編碼自噬誘導蛋白。 2. PLP2-TM誘導自噬現(xiàn)象：在HEK293T、Hela和MCF-7不同細胞中，PLP2-TM均引起綠色熒光蛋白標記的自噬體明顯聚集，并促進自噬標準蛋白LC3-II表達。在PLP2-TM轉染后不同時間，隨著轉染時間延長PLP2-TM誘導自噬體聚集更明顯，并明顯促進LC3-II表達。電子投射電鏡結果顯示，轉染PLP2-TM實驗組細胞出現(xiàn)明顯自噬體特異性雙層膜結構，陽性對照組細胞同樣出現(xiàn)自噬溶酶體特異性單層膜結構，而陰性對照組細胞沒有觀察到明顯的自噬體相關膜型結構。實驗發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3-MA特異性抑制PLP2-TM促進的LC3-II表達。 3. PLP2-TM誘導不完全自噬效應的研究：實驗組中PLP2-TM促進LC3-II表達增多但對自噬底物p62蛋白穩(wěn)定性表達沒有影響，陽性對照組中Rapamycin激活LC3-II表達且促進p62蛋白表達降低，暗示PLP2-TM誘導不完全自噬效應；PLP2-TM引起pmRFP-GFP-LC3質粒表達中綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標記自噬體的明顯聚集，陽性對照組不完全自噬誘導劑CQ處理轉染pmRFP-GFP-LC3質粒的細胞中觀察到既有綠色熒光蛋白標記自噬體聚集又有紅色熒光蛋白標記自噬體聚集，實驗組轉染PLP2-TM與陽性對照CQ誘導結果一致，而陰性對照組細胞中紅色熒光蛋白標記自噬體聚集明顯，表明PLP2-TM誘導不完全自噬效應。 4. PLP2-TM誘導自噬機制研究：（1）PLP2-TM與LC3相互作用：PLP2-TM引起明顯的綠色熒光蛋白標記自噬體聚集并且與綠色熒光蛋白eGFP-LC3B標記自噬體共定位；免疫共沉淀實驗中顯示PLP2-TM與內(nèi)源性LC3免疫共沉淀，暗示著在冠狀病毒感染過程中冠狀病毒可以通過PLP2-TM定位于自噬體膜上為冠狀病毒復制提供場所。（2）PLP2-TM與Beclin1相互作用：成功構建pcMV-Myc-Beclin1表達載體；免疫共沉淀實驗結果顯示PLP2-TM分別在過表達體系和內(nèi)源性體系中與Beclin1相互作用。本研究結果提示冠狀病毒編碼的木瓜樣蛋白酶可以類似其他病毒蛋白一樣通過結合Beclin1阻斷自噬溶酶體的形成誘導不完全自噬效應為病毒復制提供場所。（3） PLP2-TM通過去泛素酶活性降低Beclin1泛素化水平促進其表達：PLP2-TM在HEK293T、Hela和MCF-7不同細胞系中促進內(nèi)源性Beclin1表達；并且在HEK293T細胞中免疫共沉淀實驗結果顯示PLP2-TM明顯降低Beclin1泛素化水平，前期研究表明PLP2-TM具有DUB酶活性，暗示著PLP2-TM通過降低Beclin1的泛素化水平促進Beclin1表達。5. PLP2-TM對STING與Beclin1相互作用的影響：在HEK293T細胞中過表達PLP2-TM，STING和Beclin1，免疫共沉淀實驗處理，結果發(fā)現(xiàn)PLP2-TM促進STING與Beclin1相互作用；LC3與Beclin1同為自噬調(diào)節(jié)蛋白但PLP2-TM對STING與LC3之間作用沒有影響。本部分研究結果可能進一步解釋PLP2-TM通過STING負調(diào)控宿主天然免疫。 結論：NL63編碼的木瓜樣蛋白酶（PLP）是一種自噬誘導蛋白，PLP2-TM可能通過去除Beclin1泛素化水平并且與Beclin1相互作用誘導不完全自噬活性；同時PLP2-TM能夠促進STING與其誘導的自噬膜上關鍵分子Beclin1相互作用，提示PLP2-TM通過誘導的自噬體膜上Beclin1分子滯留STING，這可能阻止STING信號向下傳導從而負調(diào)控天然免疫反應。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 朱娜;譚文杰;;細胞自噬對人冠狀病毒復制與致病性的影響[J];病毒學報;2010年06期

2 趙美;臧偉進;;巨自噬在心臟疾病調(diào)節(jié)中的雙向作用[J];生理科學進展;2011年02期

3 王凱;鄭洋;邢雅玲;陳曉娟;陳忠斌;;細胞自噬在病毒感染與免疫調(diào)節(jié)中的作用機制[J];中國生物化學與分子生物學報;2011年11期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張曉延;腸道病毒71型誘導細胞自噬、凋亡及相互調(diào)控關系的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

本文編號：1290083