本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用CS-SELEX技術(shù)篩選特異性結(jié)合丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B適配子的研究

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【摘要】：目的應(yīng)用CS-SELEX(cell surface-system evolution of ligands by exponential enrichment)技術(shù)篩選與丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白4B(non protein 4B,NS4B)特異性結(jié)合的ssDNA適配子,建立檢測(cè)HCV NS4B的酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗(yàn)(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)方法。方法構(gòu)建pDisplay-NS4B質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中,在G418存在情況下連續(xù)篩選1個(gè)月,得到單克隆細(xì)胞群,經(jīng)過Western blot以及流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證,獲得穩(wěn)定表達(dá)NS4B的HepG2細(xì)胞。設(shè)計(jì)并合成隨機(jī)序列ssDNA文庫(kù),以穩(wěn)定表達(dá)NS4B的細(xì)胞為正向篩選靶細(xì)胞,以HepG2細(xì)胞為反篩細(xì)胞進(jìn)行CS-SELEX技術(shù)篩選。每輪篩選獲得的具有結(jié)合NS4B能力的ssDNA適配子,通過PCR擴(kuò)增得到富集,隨后通過不對(duì)稱PCR獲得下一輪篩選的ssDNA文庫(kù)。經(jīng)過16輪篩選,將親和力最高的篩選產(chǎn)物克隆并測(cè)序,用ELONA方法檢測(cè)適配子的親和力。結(jié)果成功構(gòu)建表面展示表達(dá)重組質(zhì)粒pDisplay-NS4B。分別將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞,通過G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)HCV-NS4B的細(xì)胞系NS4B-HepG2。對(duì)CS-SELEX篩選的各輪適配子庫(kù)進(jìn)行親和力測(cè)定,其中第14輪庫(kù)適配子與NS4B的親合力最高。分別對(duì)第14輪庫(kù)中的單個(gè)適配子進(jìn)行親和力測(cè)定,以適配子ZN1和ZN5與NS4B的親合力最高。ZN1和ZN5不僅能結(jié)合展示在細(xì)胞表面的NS4B蛋白,還能結(jié)合丙型肝炎病毒感染細(xì)胞(HCV cell culture,HCVcc)中的HCV-NS4B蛋白。結(jié)論適配子ZN1和ZN5對(duì)NS4B有高親和力,這對(duì)研究HCV-NS4B致癌機(jī)制、HCV診斷以及治療方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【作者單位】： 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖北省過敏及免疫相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家重大傳染病專項(xiàng)(No.2012ZX10003002-015) 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31221061,31270176,81471910和31370197) 國(guó)家杰出青年基金項(xiàng)目(No.81025008)
【分類號(hào)】：R373.21
【正文快照】： ***據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),全球約有3%,即1.7億~2.0億人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)[1]。我國(guó)是HCV高感染率國(guó)家之一。HCV感染后,機(jī)體免疫系統(tǒng)往往不能將其清除,約80%的HCV感染者常發(fā)展成為慢性肝炎,其中有10%~***30%的患者發(fā)展為肝硬化、1%~5%發(fā)展為晚期肝癌(

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