發(fā)布時間：2017-12-14 11:03

  本文關(guān)鍵詞：人PDE4B2全長與截短突變體的重組表達(dá)及比較

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【摘要】：對全長人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶4B2（hPDE4B2：Genebank accessionno. M97515）保留其催化結(jié)構(gòu)域得到截短突變體(152aa-528aa)；將全長hPDE4B2的編碼基因序列和截短突變編碼序列分別連到His-SUMO原核融合表達(dá)載體pReceiver-B13上，構(gòu)建兩種重組融合表達(dá)質(zhì)粒His-SUMO-PDE4B2并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL-21(DE3)中。在16℃經(jīng)過1.0mmol/L和0.2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)20h后, hPDE4B2全長和截短突變體分別獲得分子量約為77kDa和64kDa的融合蛋白,經(jīng)瓊脂糖Ni-NTA一步親和層析純化，得到純度較高的融合蛋白。 用堿性磷酸酶偶聯(lián)的孔雀綠定磷法測得純化后全長hPDE4最大比活性為0.056U·mg-1，截短突變體最大比活性為1.0U·mg~(-1)；hPDE4B2全長的Km為8.5±0.1μM (n=2)，截短突變體的Km為54±4μM(n=5)。在cAMP為60.0μM時，抑制劑Rolipram對全長hPDE4的Ki為11nM(n=2)而對截短突變體的Ki為0.33μM (n=3)，抑制劑罌粟堿PAP對全長hPDE4的K_i為5.3μM (n=2)而對截短突變體的Ki為3.4μM (n=4)。可見，截短突變體比活性更高，但其對底物及抑制劑的親和力與全長hPDE4B2不同，不能用于篩選PDE4的選擇性抑制劑。 孔雀綠定磷法能耐受高濃度的融合全長hPDE4B2純化蛋白。高達(dá)30ug/ml的靶酶在終止反應(yīng)后即使不除去變性蛋白對測定無機(jī)磷基本無干擾。在微孔板中用適量的純化融合全長hPDE4B2，，堿性磷酸酶偶聯(lián)的孔雀綠定磷法測得全長hPDE4B2的動力學(xué)參數(shù)與用分光光度計(jì)測定所得一致；在cAMP為60.0μM時，抑制劑Rolipram對融合全長hPDE4的抑制常數(shù)也與用分光光度計(jì)測定所得一致。所以，用His-SUMO原核融合表達(dá)的全長hPDE4，可用于微孔板系統(tǒng)基于堿性磷酸酶偶聯(lián)的孔雀綠定磷法高通量篩選磷酸二酯酶抑制劑。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3411

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1287639