本文關(guān)鍵詞：機(jī)械拉伸對(duì)成骨細(xì)胞基因表達(dá)及可變剪接的研究

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【摘要】：人體內(nèi)許多組織和器官都受到來(lái)自生理環(huán)境的不同類型和大小的應(yīng)力作用，骨是人體內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)和功能組織，研究應(yīng)力作用對(duì)骨組織生長(zhǎng)發(fā)育的影響有助于骨組織修復(fù)工程的發(fā)展。應(yīng)力刺激可以改變細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)和可變剪接過(guò)程，本文利用生物力學(xué)、分子生物學(xué)等手段研究拉伸刺激對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)力響應(yīng)基因的表達(dá)和可變剪接的影響，以及可能的可變剪接調(diào)控機(jī)制。 主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1和人永生化表皮細(xì)胞株HaCaT，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，MC3T3-E1細(xì)胞呈纖維樣細(xì)胞型，HaCaT細(xì)胞呈上皮樣細(xì)胞型。 將成骨細(xì)胞MC3T3-E1接種到硅橡膠膜上，應(yīng)用自主設(shè)計(jì)制作的應(yīng)力拉伸裝置對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞施加拉伸刺激，加載參數(shù)為：應(yīng)變量15%、頻率30次/min、加載時(shí)間分別為3h和6h，收集細(xì)胞提取總mRNA和蛋白，研究拉伸刺激對(duì)VEGF、CD44和cyclinD1基因表達(dá)的影響。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)拉伸前后VEGF基因主要表達(dá)剪接變異體VEGF188、VEGF164和VEGF120，CD44基因主要表達(dá)剪接變異體CD44S和CD44E，cyclinD1基因主要表達(dá)剪接變異體cyclinD1a。利用q-PCR和western blot檢測(cè)表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)拉伸刺激后VEGF及其剪接變異體VEGF164和VEGF120表達(dá)量明顯上調(diào)，cyclinD1及其剪接變異體cyclinD1a表達(dá)量明顯下調(diào)，，而CD44及其剪接變異體CD44S和CD44E表達(dá)量改變不明顯。 構(gòu)建剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-EGFP-ASF/SF2、pcDNA3.1(+)-EGFP-SC35和pcDNA3.1(+)-EGFP-hnRNPA1，轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞以模擬拉伸刺激后細(xì)胞內(nèi)剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1表達(dá)上調(diào)的狀態(tài)，研究應(yīng)力拉伸環(huán)境下剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1對(duì)VEGF基因可變剪接的影響。熒光顯微鏡下觀察到表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率約70%，western blot檢測(cè)ASF/SF2、SC35和hnRNPA1蛋白的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果證明其表達(dá)量明顯增加。且過(guò)表達(dá)ASF/SF2和SC35后VEGF剪接變異體VEGF188、VEGF164和VEGF120蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，而過(guò)表達(dá)hnRNPA1對(duì)VEGF剪接變異體的表達(dá)改變不明顯。說(shuō)明ASF/SF2和SC35參與應(yīng)力拉伸環(huán)境下對(duì)VEGF基因可變剪接的調(diào)控過(guò)程，而hnRNPA1不參與該過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：1287320