本文關鍵詞：氧化還原動態(tài)平衡調控腦細胞增殖的機制研究

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【摘要】：研究背景 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育是機體發(fā)育的重要組成部分。研究神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，對于深入研究神經(jīng)細胞的增殖、分化，以及尋求調控與干預細胞的增殖、分化作用的新靶點，具有廣泛而深遠的意義。活性氧（ROS）作為一類重要的信號分子，在機體其它組織（如肝組織）的發(fā)育過程中扮演重要的角色。本實驗類比ROS對肝細胞增殖調控的研究，探索ROS在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用，以及ROS對腦細胞增殖調控的信號作用及機制。 實驗目的 通過研究大鼠不同發(fā)育時期腦組織氧化還原動態(tài)平衡的變化規(guī)律，探討腦發(fā)育過程中ROS水平的變化與腦組織抗氧化系統(tǒng)活性變化的相互關系，提出ROS作為信號分子參與調控腦細胞增殖過程的假說。并以PC12細胞構建神經(jīng)細胞體外研究模型，闡明ROS在調控神經(jīng)細胞增殖中的作用及機制。為進一步尋求調控與干預細胞的增殖、分化作用的新靶點，提供實驗依據(jù)。 實驗方法和研究方案 1.檢測SD大鼠不同發(fā)育階段腦組織氧化還原動態(tài)平衡的變化規(guī)律，并初步研究ROS對神經(jīng)細胞增殖的調控。 （1）培養(yǎng)不同發(fā)育階段的大鼠原代神經(jīng)元，檢測神經(jīng)元的細胞周期、ROS水平以及PCNA、CyclinD、Rb等增殖蛋白表達的變化。 （2）檢測以Nrf2為核心的抗氧化酶譜的表達及活性的變化。 （3）分離不同發(fā)育階段大鼠腦組織，提取線粒體，檢測線粒體活力及線粒體ROS水平的變化。 2.體外實驗研究ROS對PC12細胞增殖作用的量效關系，以及在細胞增殖過程中的信號調控作用。 （1）構建神經(jīng)細胞體外模型——PC12細胞培養(yǎng)模型。觀察PC12細胞的生長特性，繪制生長曲線。 （2）分別在PC12細胞培養(yǎng)的過程中給予氧化劑和抗氧化劑的處理，篩選適當?shù)膭┝糠秶�，研究ROS水平與PC12細胞增殖作用的量效關系。 （3）通過處理干預PC12細胞的細胞增殖過程，測定不同處理組細胞細胞周期蛋白CyclinD、PCNA、Rb等的表達，研究ROS在細胞增殖過程中的信號調控作用。 實驗結果 1．SD大鼠出生后7-15天期間，大鼠腦組織快速發(fā)育，生長發(fā)育速率加快，代謝旺盛，呈現(xiàn)“突發(fā)性”的生長狀態(tài)。同時，ROS的產(chǎn)生與抗氧化防御系統(tǒng)的活性處于一個活躍而又平衡的狀態(tài)。 2．在大鼠的腦發(fā)育過程中，線粒體活力的變化趨勢與線粒體ROS的變化趨勢相反。在P7~15天“腦突發(fā)生長期”線粒體代謝旺盛，線粒體活力出現(xiàn)短暫的升高，之后又逐漸回落。腦組織線粒體的活力是隨著發(fā)育進程的推進而逐漸升高，，線粒體的功能也逐漸完善。 3．神經(jīng)細胞內(nèi)ROS參與調控細胞的增殖過程。在大鼠胚胎發(fā)育過程中，腦組織ROS水平由高變低，抗氧化防御系統(tǒng)功能則由低變高，說明ROS水平的變化與神經(jīng)細胞增殖和分化成熟有重要作用。從大鼠胚胎發(fā)育早期一直到大鼠出生后發(fā)育成熟，腦組織的氧化還原維持著動態(tài)平衡，ROS的水平被控制在“合適”的范圍。在腦組織中核心的轉錄因子Nrf2有序地調控或部分調控以ROS存在水平為軸心的氧化還原動態(tài)變化；自由基清除酶SOD蛋白表達逐漸下降和抗氧化酶CAT、Gpx和GR等蛋白表達逐漸升高，共同維持穩(wěn)定的氧化還原的動態(tài)平衡。由此可見，大鼠發(fā)育過程中腦組織的氧化還原狀態(tài)調節(jié)ROS的水平，而ROS的水平又參與調控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。 4．使用氧化劑t-叔丁基過氧化氫（t-BHP）和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）分別處理對數(shù)生長期的PC12細胞。t-BHP處理PC12細胞，表現(xiàn)出明顯的劑量 效應關系，適當劑量的t-BHP（1μM）可以通過激活ERK通路促進細胞增殖。NAC可以顯著降低細胞ROS水平，并通過激活p38信號通路一定程度地抑制細胞增殖。同時，使用p38抑制劑能夠有效阻斷NAC對細胞增殖的抑制作用。該結果說明，ROS水平的變化能夠通過激活ERK或p38信號通路，促進或抑制PC12細胞的增殖。 結論 本課題從大鼠腦組織發(fā)育過程中ROS水平的變化與抗氧化防御系統(tǒng)的變化相矛盾這一現(xiàn)象，提出“大鼠發(fā)育過程中腦組織的氧化還原狀態(tài)調節(jié)ROS的水平，而ROS的水平又參與調控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育”的猜想。又通過體外實驗研究進一步發(fā)現(xiàn)，分別給予PC12細胞氧化劑和抗氧化劑處理，發(fā)現(xiàn)細胞ROS水平的變化能夠通過激活ERK或p38信號通路促進或抑制細胞增殖。從正反兩個方面證明ROS作為重要信號分子參與PC12細胞的增殖調控。這為論證“ROS水平可以調控神經(jīng)細胞的增殖狀態(tài)”提供了堅實的依據(jù)，也為深入闡明ROS在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中具體的作用機制提供新的思路和方向。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R338

【參考文獻】

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本文編號：1284795