發(fā)布時(shí)間：2017-12-07 16:18

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-144抑制小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1表達(dá)

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【摘要】：目的：構(gòu)建miR-144真核表達(dá)載體，檢測(cè)miR-144是否調(diào)控小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）的表達(dá)。 方法：結(jié)合文獻(xiàn)，通過(guò)預(yù)測(cè)軟件分析，選取評(píng)分較高、可作用于ABCA1mRNA3’非編碼區(qū)（ABCA1mRNA3’UTR）的miR-144。通過(guò)分子克隆技術(shù)，利用PCR擴(kuò)增miR-144和ABCA1mRNA3’UTR的DNA序列，酶切膠回收后，分別連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）載體和pcDNA3.1（+）-luciferase載體上。測(cè)序后，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性，觀察microRNA-144是否對(duì)ABCA1mRNA3’UTR具有直接靶向作用。運(yùn)用LipofectamineTM2000將pcDNA3.1（+）空載體、pcDNA3.1（+）-miR-144轉(zhuǎn)染至小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-144的表達(dá)含量。通過(guò)qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-144后ABCA1在mRNA和蛋白水平的變化。 結(jié)果：miR-144PCR產(chǎn)物連接至pcDNA3.1（+）載體上，ABCA1mRNA3’UTR連接至pcDNA3.1（+）-luciferase載體上，測(cè)序正確。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組（聯(lián)合轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）空載、pcDNA3.1（+）-luciferase-ABCA13’ UTR和PRL-SV40）相比，實(shí)驗(yàn)組（聯(lián)合轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-miR144、pcDNA3.1（+）-luciferase-ABCA13’ UTR和PRL-SV40可以顯著降低螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性（P＜0.05），證明microRNA-144對(duì)ABCA1mRNA3’UTR具有直接靶向作用。將pcDNA3.1（+）空載、pcDNA3.1（+）-miR-144轉(zhuǎn)染至小鼠RAW264.7細(xì)胞中，，qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）空載組microRNA-144表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-miR-144組中miR-144表達(dá)量顯著增高（P＜0.01）.qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）空載和pcDNA3.1（+）-microRNA-144對(duì)ABCA1mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯影響（P＞0.05），Western blot結(jié)果顯示，與pcDNA3.1（+）空載組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-microRNA-144可以顯著降低ABCA1蛋白水平的表達(dá)（P＜0.01）。 結(jié)論：miR-144可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制ABCA1蛋白的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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9 劉玲娟;microRNA-204調(diào)控驚厥性腦損傷的機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2014年

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王建敏;不同血液凈化方式尿毒癥患者血清對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞microRNA33a的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

2 向羿;嚴(yán)重冠心病患者血清ABCA1水平與側(cè)支循環(huán)形成的相關(guān)性研究[D];中南大學(xué);2013年

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5 劉美英;脂蛋白脂酶基因多態(tài)性與2型糖尿病和血脂關(guān)系的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2014年

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10 曹峻榮;miR-144靶向ROCK1抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究[D];南華大學(xué);2014年

本文編號(hào)：1262993