本文關(guān)鍵詞：Mas基因沉默對血管緊張素-（1-7）拮抗血管緊張素Ⅱ誘導的腎間質(zhì)成纖維細胞活化的影響

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【摘要】：目的:探討Mas基因沉默后對血管緊張素-(1-7)[angiotensin-(1 7)，Ang-(1-7)]拮抗血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導的大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞(NRK-49F)活化的影響。方法：在體外傳代培養(yǎng)NRK-49F，當培養(yǎng)瓶中細胞生長至70-80%融合后，用細胞培養(yǎng)基稀釋成密度為1×105/ml的細胞懸液并接種于六孔板中用于實驗。在我們的前期實驗中根據(jù)Mas基因序列設計合成3對不同位點的小分子干擾RNA(small interfering RNA， SiRNA)并采用HiPerFectTransfection Reagent瞬時轉(zhuǎn)染NRK-49F，48h后通過用半定量PCR(semi-quantitative PCR，RT-PCR)法檢測Mas mRNA的表達和用蛋白免疫印記法(Western blot)檢測Mas蛋白的表達，已證實MasSiRNA能有效的沉默Mas基因的表達并篩選出了對Mas基因沉默效果最佳的一對Mas SiRNA序列。為進一步研究有效Mas SiRNA沉默Mas基因后對Ang-(1-7)拮抗AngⅡ誘導的NRK-49F活化的影響，我們將已篩選出的有效序列Mas SiRNA瞬時轉(zhuǎn)染NRK-49F，根據(jù)不同的干預因素實驗分為6組：①正常對照組(NG):細胞中僅加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基，即正常培養(yǎng)基，②AngⅡ組：細胞中加入含終濃度為10-6mol/LAngⅡ的正常培養(yǎng)基，③Ang-(1-7)組：細胞中加入含終濃度為10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培養(yǎng)基，④AngⅡ+Ang-(1-7)組：細胞中同時加入含終濃度為10-6mol/LAngⅡ和終濃度為10-5mol/LAng-(1-7)的正常培養(yǎng)基，⑤陰性SiRNA對照組：細胞在陰性序列siRNA轉(zhuǎn)染48h后加入含10-6mol/L AngⅡ和10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培養(yǎng)基，⑥Mas SiRNA轉(zhuǎn)染組：細胞在有效Mas siRNA轉(zhuǎn)染48h后加入含10-6mol/L AngⅡ和10-5mol/LAng-(1-7)的正常培養(yǎng)基。將上述各組細胞分別培養(yǎng)72h后，采用細胞免疫化學法檢測NRK-49F活化標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)的表達，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測上清液中細胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原(collagenⅠ，ColⅠ)的含量。結(jié)果：細胞免疫化學法檢測結(jié)果表明有效Mas SiRNA轉(zhuǎn)染組在加AngⅡ+Ang-(1-7)干預72h后，顯微鏡下可見細胞肥大，細胞胞漿所占體積比例增多，，在胞漿內(nèi)能觀察到棕黃色顆粒，界限清楚，與AngⅡ組的細胞形態(tài)相似，經(jīng)半定量分析數(shù)據(jù)結(jié)果顯示較非轉(zhuǎn)染AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉(zhuǎn)染組α-SMA表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；而AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉(zhuǎn)染組α-SMA的表達無明顯差異(P0.05)，正常對照組與Ang-(1-7)組幾無α-SMA的陽性表達。ELISA檢測結(jié)果表明細胞加AngⅡ+Ang-(1-7)干預72h后，有效Mas SiRNA轉(zhuǎn)染組較非轉(zhuǎn)染AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉(zhuǎn)染組細胞上清液中ColⅠ的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；而AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉(zhuǎn)染組上清液中ColⅠ的含量無明顯差異(P0.05)，正常對照組與Ang-(1-7)組細胞上清液中僅有基礎量的ColⅠ分泌。結(jié)論：通過Mas SiRNA有效序列干擾NRK-49F中Mas基因的表達后，Ang-(1-7)拮抗AngⅡ誘導的NRK-49F活化作用明顯減弱。提示Ang-(1-7)可能通過作用于Mas受體發(fā)揮其拮抗AngⅡ?qū)RK-49F的激活作用。
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：1259911