本文關(guān)鍵詞：G6PD在AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激中的作用

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【摘要】：目的：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD），是哺乳動(dòng)物中一個(gè)重要的看家酶；在磷酸戊糖途徑中為首個(gè)限速酶，廣泛分布于全身各組織細(xì)胞內(nèi)。G6PD是機(jī)體正常的新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育過程中必不可少的一種酶；對(duì)維持胞漿池的NADPH和細(xì)胞的氧化還原平衡是不可缺少的。G6PD基因突變會(huì)造成G6PD蛋白部分功能的缺失，可導(dǎo)致新生兒黃疸，藥物或感染介導(dǎo)的溶血危象，蠶豆病等。最近的研究顯示G6PD在細(xì)胞和生物體的生理機(jī)能等方面具有重要作用。G6PD活性缺失，會(huì)干擾氧化還原的平衡狀態(tài)，可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)和信號(hào)傳導(dǎo)異常，還會(huì)出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常，增加退化性疾病的易感性等。但到目前為止，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，G6PD的活性變化以及與磷酸戊糖途徑的關(guān)系尚不清楚，因此，研究G6PD的活性變化對(duì)了解如何維持細(xì)胞內(nèi)NADPH和細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)以及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制都具有十分重要的意義。 人類的G6PD基因是一個(gè)X連鎖遺傳基因，位于Xq28區(qū)域，包含有13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)約有21kb。第一個(gè)外顯子沒有編碼序列，位于第2和3外顯子中間的內(nèi)含子長(zhǎng)約9kb。 血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是由血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化生成的多肽（八肽）物質(zhì)；是腎素－血管緊張素系統(tǒng)RAS中最為重要的活性物質(zhì)。RAS在維持機(jī)體血壓穩(wěn)定及調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡中發(fā)揮了重要作用。RAS活性的變化與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展具有密切相關(guān)性。在動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中，AngⅡ通過多種效應(yīng)參與。AngⅡ刺激導(dǎo)致血管產(chǎn)生過量的自由基，進(jìn)一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，發(fā)生炎癥反應(yīng)和功能障礙，成為動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)。但是血管內(nèi)皮細(xì)胞在處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)出現(xiàn)什么樣的變化？G6PD活性會(huì)有怎樣變化以及與磷酸戊糖途徑又有什么關(guān)系，尚不清楚。 基于上述情況，本實(shí)驗(yàn)選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）作為研究對(duì)象，使用AngⅡ刺激細(xì)胞復(fù)制氧化應(yīng)激的模型，觀察細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）、NADP/NADPH及G6PD蛋白的變化。對(duì)AngⅡ致HUVEC的氧化應(yīng)激時(shí)，G6PD的變化以及與磷酸戊糖途徑的關(guān)系進(jìn)行研究。 方法： 1細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株用含有100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24小時(shí)，換用無血清的DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24小時(shí)。然后換用含有刺激因素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至所需時(shí)間后，收集細(xì)胞或上清液用于以下實(shí)驗(yàn)。 2活性氧（ROS）的檢測(cè) (1)分別給予細(xì)胞0，10-6，10-7，10-8mmol/L AngⅡ刺激，作用相同的時(shí)間1h后，采用活性氧檢測(cè)試劑盒對(duì)不同濃度產(chǎn)生的活性氧進(jìn)行檢測(cè)。 (2)用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ，分別給予細(xì)胞0h，0.5h，1h， 3h的刺激后，采用活性氧檢測(cè)試劑盒對(duì)不同時(shí)間產(chǎn)生的活性氧進(jìn)行檢測(cè)。3NADP/NADPH的變化檢測(cè) 給予細(xì)胞相同濃度（10-6mmol/L）AngⅡ的刺激后，分別作用0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min后收取細(xì)胞，按試劑盒說明書熔煉細(xì)胞2次，進(jìn)行測(cè)定。 4G6PD活性變化測(cè)定 給予細(xì)胞相同濃度（10-6mmol/L）AngⅡ的刺激后，分別作用0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min后收取細(xì)胞，裂解蛋白并定量，凍于-70℃。按試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。 5G6PD蛋白表達(dá)變化檢測(cè) 給予細(xì)胞相同濃度（10-6mmol/L）AngⅡ的刺激后，分別作用0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min后收取細(xì)胞，提取蛋白，Western Blotting對(duì)G6PD進(jìn)行測(cè)定。 6NOS及NO的檢測(cè) (1)分別給予細(xì)胞0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ的刺激后，收取細(xì)胞上清液，采用NO試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。 (2)分別給予細(xì)胞0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ的刺激后，收取細(xì)胞上清液，采用NOS試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。 7數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均用X S表示，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行處理，對(duì)所測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），以P 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1AngⅡ刺激HUVEC后ROS的產(chǎn)生增多。 (1)不同濃度的AngⅡ(0，10-6，10-7，10-8mmol/L)刺激細(xì)胞1h后，熒光顯微鏡下觀察，以10-6mmol/L時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。 (2)用10-6mmol/L AngⅡ刺激細(xì)胞0h，0.5h，1h，3h，，6h后，熒光顯微鏡下觀察，以1h時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。 2HUVEC氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展過程中NADP/NADPH（Ratio）逐步下降。 用10-6mmol/L AngⅡ分別給予細(xì)胞0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min刺激后： 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NADP/NADPH（Ratio）5min明顯增加后，逐步下降，于1時(shí)達(dá)到最低。 NADP/NADPH的變化提示在氧化應(yīng)激發(fā)生、發(fā)展過程中，磷酸戊糖途徑的代謝活性短暫受到抑制后，逐步增強(qiáng)。 3內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生、發(fā)展過程中G6PD的活性及含量的變化。 HUVEC給予10-6mmol/L AngⅡ刺激后，分別于0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min檢測(cè)。結(jié)果表明，G6PD的活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先下降后上升的變化規(guī)律，說明氧化應(yīng)激初始期G6PD活性受到抑制，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其活性逐漸恢復(fù)。而G6PD蛋白表達(dá)的變化與G6PD活性的改變呈平行關(guān)系。 4AngⅡ刺激HUVEC后可使NO的含量、NOS的活性下降。 用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ分別給予細(xì)胞0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min刺激。 A細(xì)胞中NO表達(dá)水平在5min時(shí)升高，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降性趨勢(shì)，并于1時(shí)達(dá)到最低峰。 B細(xì)胞中NOS活性同樣在5min時(shí)出現(xiàn)升高，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降性趨勢(shì)。 細(xì)胞內(nèi)NO含量的降低及NOS活性的下降，說明內(nèi)皮細(xì)胞的功能受損。 結(jié)論： 110-6mmol/L AngⅡ孵育HUVEC1h是體外建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的最佳條件。 2氧化應(yīng)激通過改變G6PD的活性干擾磷酸戊糖途徑及代謝穩(wěn)態(tài)，促發(fā)內(nèi)皮功能障礙。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王t$椺;王仁華;劉曉蘭;;精氨酸對(duì)母豬的營養(yǎng)作用與應(yīng)用[J];飼料工業(yè);2013年24期

2 皮蕾;姜儻;黃彬;歐陽涓;陳培松;崔穎鵬;劉云鋒;郭彩嬌;;腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷中的轉(zhuǎn)分化——獲得組織干細(xì)胞潛能的研究[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2014年14期

3 Abdoul Karim Ouattara;Cyrille Bisseye;Bapio Valery Jean Télesphore Elvira Bazie;Birama Diarra;Tegwindé Rebeca Compaore;Florencia Djigma;Virginio Pietra;Remy Moret;Jacques Simpore;;Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) deficiency is associated with asymptomatic malaria in a rural community in Burkina Faso[J];Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine;2014年08期

4 李晶晶;溫冬梅;張秀明;;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測(cè)定方法及其與糖尿病和糖化血紅蛋白關(guān)系的研究進(jìn)展[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2014年18期

5 邱宇安;陳火國;李麗紅;靳文劍;黃紹烈;;黃芪含藥血清對(duì)血管緊張素Ⅱ致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J];重慶醫(yī)學(xué);2015年06期

6 陳永權(quán);付群;金孝\

本文編號(hào)：1244904