本文關(guān)鍵詞：人ATG4B的表達及蛋白純化和鑒定

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【摘要】：目的構(gòu)建含His標簽的自噬相關(guān)蛋白4同源物B(ATG4B)重組質(zhì)粒以得到His-ATG4B蛋白,初步鑒定其生物學(xué)活性。方法利用PCR技術(shù)從人乳腺文庫中擴增出ATG4B基因的編碼序列,插入p ET-28a(+)載體中得到重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定后轉(zhuǎn)化Rossate菌,挑選小量誘導(dǎo)出的His-ATG4B菌液進行His-ATG4B蛋白的純化,SDS-PAGE和Western blot法檢測His-ATG4B蛋白的純化效果,GST pull-down技術(shù)對蛋白生物學(xué)功能進行鑒定。結(jié)果用PCR技術(shù)從人乳腺文庫中擴增得到大小約1100 bp的目的片段,插入p ET-28a(+)載體中構(gòu)建出His-ATG4B重組質(zhì)粒,酶切鑒定及測序結(jié)果均表明His-ATG4B質(zhì)粒構(gòu)建成功;轉(zhuǎn)化Rossate菌并小量誘導(dǎo),表達鑒定成功后純化蛋白,得到相對分子質(zhì)量(Mr)約為47 000的His-ATG4B蛋白,且SDS-PAGE檢測蛋白純化效果較好;GST pull-down實驗證實His-ATG4B蛋白可以和LC3B蛋白在體外相互作用,生物學(xué)活性良好。結(jié)論本實驗成功得到His-ATG4B蛋白,為研究ATG4B在自噬中的作用機制奠定實驗基礎(chǔ)。
【作者單位】： 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所;解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院;總參警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(31100604) 院創(chuàng)新基金(ZHYX003)
【分類號】：R3411
【正文快照】： 自噬相關(guān)蛋白4同源物B(autophagy-relatedprotein 4 homolog B,ATG4)是一種半胱氨酸蛋白酶,在細胞發(fā)生自噬的過程中,通過剪切和去脂作用調(diào)節(jié)ATG8蛋白的脂化修飾[1]。研究發(fā)現(xiàn),在酵母細胞中至少有19種自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,ATG)參與了自噬小體的形成[2],其中ATG

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