本文關鍵詞：mTOR在TLR信號通路中對前炎癥細胞因子表達的調(diào)控機制研究

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【摘要】：目的：研究mTOR激酶在小鼠原代細胞TLR信號通路中對相關前炎癥細胞因子的表達調(diào)控，尋找其調(diào)控的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，探索其分子調(diào)節(jié)機制。為進一步研究TLR信號通路的調(diào)控及mTOR相關疾病的治療提供靶點。 方法：分離純化小鼠DC，pMΦ和BMDM。用雷帕霉素預處理小鼠DC30min阻斷mTOR激酶后，用LPS激活DC TLR信號通路，不同時間點提取細胞總RNA，通過qPCR檢測多種前炎癥細胞因子mRNA水平進行初篩，尋找mTOR調(diào)節(jié)的靶基因；根據(jù)篩選結果用qPCR在小鼠原代細胞pMΦ與BMDM中進一步檢測IL-10、IL-12、IL-23、CXCL1和TNFα；采用LPS和R848分別對pMΦ進行單刺激和共刺激處理，ELISA法檢測mTOR調(diào)節(jié)的前炎癥細胞因子IL-10、IL-12和IL-23的蛋白表達水平；雷帕霉素預處理pMΦ約30min后,用LPS進行誘導,分別于1h、2h、4h、8h提取細胞總蛋白，采用western bolt檢測mTOR對TLR4信號通路中MAPKs家族（ERK1/2、JNK1/2/3、p38）、IKKα/β、IκBα激酶及IRF3轉(zhuǎn)錄因子的激活情況。阻斷mTOR后分離細胞核蛋白，用western bolt檢測mTOR調(diào)節(jié)的靶轉(zhuǎn)錄因子，進一步在總蛋白水平檢測mTOR調(diào)節(jié)的S6K1和4E-BP1激酶的磷酸化水平；構建pLKO.1-cMaf和pLKO.1-stat3慢病毒載體和包裝慢病毒，分別沉默BMDM中的目標轉(zhuǎn)錄因子，檢測mTOR對前炎癥細胞因子IL-10、IL-12和IL-23的表達的影響。 結果：用雷帕霉素阻斷mTOR激酶后，檢測了TLR4信號通路中IL-10、IL-12、IL-23、CXCL1和TNFα等多種分子的表達情況，結果顯示mTOR能夠特異性促進IL-10及抑制IL-12和IL-23的表達。LPS和R848單獨和組合刺激時，mTOR對細胞因子的調(diào)節(jié)作用均為共刺激組強于單刺激組，且mTOR的調(diào)節(jié)作用與雷帕霉素呈劑量依賴性關系。蛋白水平檢測結果發(fā)現(xiàn)：在pMΦ中激活的TLR4信號通路中，mTOR不參與調(diào)節(jié)MAPKs家族激酶（ERK、JNK和p38）的激活，及其NF-κB上游激酶IKKα/β、IκBα信號的激活。檢測IRF3信號，發(fā)現(xiàn)mTOR也不影響IRF3的激活及下游IFN-β和CXCL10的表達。提取并檢測細胞核蛋白發(fā)現(xiàn)：mTOR能特異性影響轉(zhuǎn)錄因子cMaf和stat3，而不影響ATF2、β-catenin等其它多種核轉(zhuǎn)錄因子的入核。進一步檢測細胞總蛋白中cMaf和stat3的表達，結果顯示抑制mTOR后能夠顯著降低cMaf總蛋白的合成及顯著抑制stat3的磷酸化，而不影響stat3總蛋白的合成。在BMDM中沉默轉(zhuǎn)錄因子cMaf，，檢測LPS和R848組合刺激的TLRs信號通路中細胞因子的表達水平，發(fā)現(xiàn)IL-12p40和IL-12p70的表達顯著升高，IL-10的表達顯著下降，而IL-23p19的表達不受影響。沉默轉(zhuǎn)錄因子stat3，檢測相應細胞因子的的表達水平，結果顯示IL-10、IL-12p40、IL-12p70和IL-23p19的表達水平均升高。 結論： 1.在TLR4、TLR7/8信號通路中mTOR能夠促進IL-10和抑制IL-12、IL-23前炎癥細胞因子的表達。 2.在TLR4信號通路中mTOR不參與調(diào)節(jié)MAPKs激酶家族（ERK、JNK、p38）和IKK激酶的信號激活。 3.在TLR4、TLR7/8信號通路中mTOR通過促進轉(zhuǎn)錄因子cMaf的翻譯增強IL-10及抑制IL-12的表達，通過促進stat3磷酸化抑制IL-10、IL-12和IL-23的表達。
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363

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