發(fā)布時(shí)間：2017-11-29 19:20

  本文關(guān)鍵詞：mTOR在TLR信號(hào)通路中對(duì)前炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】：目的：研究mTOR激酶在小鼠原代細(xì)胞TLR信號(hào)通路中對(duì)相關(guān)前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控，尋找其調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，探索其分子調(diào)節(jié)機(jī)制。為進(jìn)一步研究TLR信號(hào)通路的調(diào)控及mTOR相關(guān)疾病的治療提供靶點(diǎn)。 方法：分離純化小鼠DC，pMΦ和BMDM。用雷帕霉素預(yù)處理小鼠DC30min阻斷mTOR激酶后，用LPS激活DC TLR信號(hào)通路，不同時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞總RNA，通過qPCR檢測(cè)多種前炎癥細(xì)胞因子mRNA水平進(jìn)行初篩，尋找mTOR調(diào)節(jié)的靶基因；根據(jù)篩選結(jié)果用qPCR在小鼠原代細(xì)胞pMΦ與BMDM中進(jìn)一步檢測(cè)IL-10、IL-12、IL-23、CXCL1和TNFα；采用LPS和R848分別對(duì)pMΦ進(jìn)行單刺激和共刺激處理，ELISA法檢測(cè)mTOR調(diào)節(jié)的前炎癥細(xì)胞因子IL-10、IL-12和IL-23的蛋白表達(dá)水平；雷帕霉素預(yù)處理pMΦ約30min后,用LPS進(jìn)行誘導(dǎo),分別于1h、2h、4h、8h提取細(xì)胞總蛋白，采用western bolt檢測(cè)mTOR對(duì)TLR4信號(hào)通路中MAPKs家族（ERK1/2、JNK1/2/3、p38）、IKKα/β、IκBα激酶及IRF3轉(zhuǎn)錄因子的激活情況。阻斷mTOR后分離細(xì)胞核蛋白，用western bolt檢測(cè)mTOR調(diào)節(jié)的靶轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步在總蛋白水平檢測(cè)mTOR調(diào)節(jié)的S6K1和4E-BP1激酶的磷酸化水平；構(gòu)建pLKO.1-cMaf和pLKO.1-stat3慢病毒載體和包裝慢病毒，分別沉默BMDM中的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子，檢測(cè)mTOR對(duì)前炎癥細(xì)胞因子IL-10、IL-12和IL-23的表達(dá)的影響。 結(jié)果：用雷帕霉素阻斷mTOR激酶后，檢測(cè)了TLR4信號(hào)通路中IL-10、IL-12、IL-23、CXCL1和TNFα等多種分子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示mTOR能夠特異性促進(jìn)IL-10及抑制IL-12和IL-23的表達(dá)。LPS和R848單獨(dú)和組合刺激時(shí)，mTOR對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用均為共刺激組強(qiáng)于單刺激組，且mTOR的調(diào)節(jié)作用與雷帕霉素呈劑量依賴性關(guān)系。蛋白水平檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在pMΦ中激活的TLR4信號(hào)通路中，mTOR不參與調(diào)節(jié)MAPKs家族激酶（ERK、JNK和p38）的激活，及其NF-κB上游激酶IKKα/β、IκBα信號(hào)的激活。檢測(cè)IRF3信號(hào)，發(fā)現(xiàn)mTOR也不影響IRF3的激活及下游IFN-β和CXCL10的表達(dá)。提取并檢測(cè)細(xì)胞核蛋白發(fā)現(xiàn)：mTOR能特異性影響轉(zhuǎn)錄因子cMaf和stat3，而不影響ATF2、β-catenin等其它多種核轉(zhuǎn)錄因子的入核。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中cMaf和stat3的表達(dá)，結(jié)果顯示抑制mTOR后能夠顯著降低cMaf總蛋白的合成及顯著抑制stat3的磷酸化，而不影響stat3總蛋白的合成。在BMDM中沉默轉(zhuǎn)錄因子cMaf，，檢測(cè)LPS和R848組合刺激的TLRs信號(hào)通路中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)IL-12p40和IL-12p70的表達(dá)顯著升高，IL-10的表達(dá)顯著下降，而IL-23p19的表達(dá)不受影響。沉默轉(zhuǎn)錄因子stat3，檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞因子的的表達(dá)水平，結(jié)果顯示IL-10、IL-12p40、IL-12p70和IL-23p19的表達(dá)水平均升高。 結(jié)論： 1.在TLR4、TLR7/8信號(hào)通路中mTOR能夠促進(jìn)IL-10和抑制IL-12、IL-23前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。 2.在TLR4信號(hào)通路中mTOR不參與調(diào)節(jié)MAPKs激酶家族（ERK、JNK、p38）和IKK激酶的信號(hào)激活。 3.在TLR4、TLR7/8信號(hào)通路中mTOR通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子cMaf的翻譯增強(qiáng)IL-10及抑制IL-12的表達(dá)，通過促進(jìn)stat3磷酸化抑制IL-10、IL-12和IL-23的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363

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4 周婷玉　g品

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