發(fā)布時間：2017-11-27 09:09

  本文關鍵詞：衰老過程中小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生及微環(huán)境改變的初步研究

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【摘要】：目的 成年哺乳動物的腦內保留著一群具有自我更新能力和多方向分化潛能的細胞群，被稱之為神經(jīng)干細胞（NSCs）。神經(jīng)干細胞經(jīng)歷不對稱分裂成為定向祖細胞，并逐漸向功能區(qū)域遷移、發(fā)生可塑性變化并與其他神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，最終具有神經(jīng)元功能，這個過程是神經(jīng)發(fā)生。神經(jīng)發(fā)生對維持大腦功能和結構有著重要的作用。在哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)中存在兩個主要的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域：海馬齒狀回顆粒下層和側腦室下區(qū)。海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生與高級功能，如學習、認知、記憶等密切相關。有文獻報道成年海馬神經(jīng)干細胞通常處在靜止狀態(tài)，在整個壽命中會重復幾次離開G0期，進行不對稱分裂并在特定的微環(huán)境下調控下向神經(jīng)元、少突膠質細胞或星型膠質細胞分化，然后再進入靜止期。在衰老期，海馬的新生神經(jīng)元產(chǎn)生減少，這與記憶、認知功能下降密切相關。關于衰老期海馬神經(jīng)發(fā)生減少的原因，目前研究人員的意見并不統(tǒng)一，歸納起來有四種猜測：1.海馬DG神經(jīng)干細胞大量凋亡；2.神經(jīng)干細胞數(shù)量不變，但處于靜止期的神經(jīng)干細胞比例上升，3.神經(jīng)干細胞數(shù)量不改變，但向膠質細胞方向分化的比例升高；4.神經(jīng)干細胞分化形成新生的神經(jīng)元迅速大量凋亡。 衰老過程中神經(jīng)發(fā)生減少已經(jīng)成為共識，但衰老期海馬神經(jīng)發(fā)生的具體哪個階段停滯或異常導致新生神經(jīng)元減少，與海馬中哪些因素的改變相關等問題還有待深入研究。本研究擬通過測定青年、中年、老年三個年齡段小鼠海馬齒狀回SGZ細胞的增殖能力、向神經(jīng)元方向分化的能力、神經(jīng)干細胞本身的數(shù)量改變、新生成神經(jīng)元的數(shù)量幾方面探討衰老進程中小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的改變；通過對金屬基質蛋白酶9的表達、神經(jīng)營養(yǎng)因子含量的改變和海馬過氧化損傷及抗氧化能力觀察不同年齡階段海馬微環(huán)境的改變；并進一步檢測海馬中衰老相關基因的表達。研究的目的是了解衰老小鼠中海馬神經(jīng)發(fā)生及其內環(huán)境的改變，為促進海馬神經(jīng)發(fā)生、延緩衰老，改善學習、認知、記憶能力，提供可能途徑和實驗依據(jù)。 方法 1. C57BL/6J雄性小鼠27只，分為青年A組9只（2-3月齡），中年B組9只（6-8月齡），老年C組9只（18-20月齡）。 2.麻醉灌注后斷頭取腦，石蠟包埋，作海馬區(qū)冠狀連續(xù)切片，隨機選取一個半腦，OCT包埋,海馬區(qū)冠狀連續(xù)冰凍切片，每只鼠選取三張非連續(xù)切片（按解剖標志保證組間位于相同平面），免疫組化（SP法）檢測并計數(shù)海馬SGZ區(qū)nestin+(神經(jīng)干細胞的標志)、DCX+（成神經(jīng)細胞）、PCNA+（增殖活躍）的細胞個數(shù)。 3.斷頭取腦，矢狀分成左右兩部分，隨機選取一個半腦，OCT包埋,海馬區(qū)冠狀連續(xù)冰凍切片，每只鼠選取三張非連續(xù)切片（按解剖標志保證組間位于同一平面），MMP-9（金屬基質蛋白酶9，基質退化程度指標）免疫熒光染色，β-半乳糖苷酶（衰老程度指標）染色。 4.麻醉后斷頭取腦，分離海馬，勻漿，離心收集上清，比色法測GSH含量和GSH-PX活性（抗氧化能力指標），硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA，氧化損傷程度指標)含量。 5.麻醉后斷頭取腦、分離海馬、勻漿，離心收集上清、ELISA檢測各年齡組小鼠海馬神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF的改變。 6.斷頭取腦，分離海馬，提取海馬組織總RNA,RT-PCR檢測各年齡組小鼠海馬衰老相關基因p19Arf、p21Cip1/Waf1mRNA表達的改變。 結果 1.海馬神經(jīng)發(fā)生指標顯示： 1）海馬SGZ NSCs(nestin+細胞)數(shù)分別在青年A組為(61.33±23.02)，中年B組(35±11.53)，老年C組(19.33±8.33)；NSCs數(shù)量隨著年齡增長減少。 2）海馬SGZ增殖活躍期的細胞數(shù)（PCNA+細胞）數(shù)分別在青年A組為(56.67±9.29)，中年B組(19±6.24)，老年C組（4.33±2.08）；SGZ增殖活躍細胞數(shù)量隨著年齡增長減少。 3）海馬SGZ成神經(jīng)細胞（NBs，DCX+細胞)數(shù)分別在青年A組為(82.33±8.50),中年B組(30±3)，老年C組(12.33±1.52)；SGZ NBs數(shù)量隨著年齡增長減少。 2.海馬神經(jīng)發(fā)生微環(huán)境指標顯示： 1）抗氧化能力指標與氧化損傷程度：各年齡組海馬組織谷胱甘肽（GSH）的含量分別是青年A組(9.77±3.125)mg/gprot，中年B組(4.94±1.59)mg/gprot，老年組(3.94±1.11)mg/gprot；GSH-PX的活性分別是：青年A組（124.09±23.34)活力單位，中年B組（106.48±14.24）活力單位，老年C組(60.621±14.71)活力單位；隨著年齡增長海馬組織中GSH含量下降、GSH-PX活性減弱。MDA含量分別為青年A組(8.3±0.8)nmol/mg，中年B組(9.7±1.57)nmol/mg,老年C組(12.8±1.9)nmol/mg；脂質氧化物（MDA）含量增加。 2）β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色：各組海馬CA區(qū)β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）陽性強度隨年齡增加逐漸增高，β-半乳糖苷酶染色陽性區(qū)域集中在CA區(qū)，DG區(qū)未見表達。 3）各年齡小鼠海馬組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平: BDNF含量在青年A組為(107.42±18.55)pg/ml，中年B組為(89.04±15.7) pg/ml，老年組C為(58.45±15.29) pg/ml；GDNF含量在青年A組為(384.56±59.12)pg/ml；中年B組為(297.59±14.69) pg/ml；老年C組為(203.33±34.83)pg/ml。 4）海馬組織金屬基質蛋白酶MMP-9表達，在衰老期明顯增高，主要集中在CA區(qū)，DG區(qū)未見表達。 3.衰老小鼠海馬衰老相關基因p19Arf、p21Cip1/Waf1mRNA表達增高。 結論 1．自然衰老小鼠海馬SGZ處于增殖活躍期細胞數(shù)、神經(jīng)干細胞的數(shù)量和成神經(jīng)細胞數(shù)量，與青年期相比都明顯減少，提示自然衰老的小鼠海馬SGZ神經(jīng)發(fā)生減少。 2.自然衰老小鼠海馬組織抗氧化能力的下降、氧化損傷程度增強，神經(jīng)營養(yǎng)因子水平下降，金屬基質蛋白酶MMP-9表達增加，可能與海馬SGZ神經(jīng)發(fā)生減少相關。 3.自然衰老小鼠海馬組織，，衰老相關基因p19Arf、p21Cip1/Waf1mRNA表達增高，提示p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信號通路可能與海馬神經(jīng)發(fā)生的下降相關。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R339.38

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：1231312