本文關(guān)鍵詞：小鼠胚胎干細胞條件培養(yǎng)基促進人脂肪干細胞增殖

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【摘要】：目的： 用小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cell，，mES）條件培養(yǎng)液（conditionmedium，CM）培養(yǎng)人脂肪干細胞（human adipose derived stem cells，hADSC），檢測hADSC的增殖速率，試圖找到一種能夠促進hADSC快速增殖并不影響細胞性質(zhì)的方法。 方法： hADSC提取培養(yǎng)及鑒定——hADSC分離傳代培養(yǎng)；MTT法檢測hADSC的增殖活性；hADSC的細胞表面標記和細胞周期的流式細胞儀的檢測；成骨成脂分化能力分別用茜素紅和油紅O染色進行鑒定。 mES未分化狀態(tài)的鑒定以及條件培養(yǎng)基的制備——mES培養(yǎng)液中添加LIF（leukemia inhibitory factor）培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上傳代，抑制細胞分化；mES的RNA提取后用PCR鑒定其多能性因子的表達情況；收集培養(yǎng)了未分化狀態(tài)的mES24h后的培養(yǎng)液，過濾后即為CM培養(yǎng)液（condition medium）。 CM培養(yǎng)液培養(yǎng)hADSC，檢測生化分子指標——將hADSC分為三組，分別用hADSC培養(yǎng)液、40%CM培養(yǎng)液和40%ES培養(yǎng)液來進行培養(yǎng)，分為ADSC組，CM組，ES組。流式細胞儀檢測三組細胞表面標記，PCR檢測hADSC的細胞特異性表達基因c-kit和sca-1的表達用來鑒定細胞性質(zhì)變化；用MTT檢測三組細胞增殖速率，三組細胞計數(shù)制備生長曲線，通過流式細胞儀檢測細胞周期；Q-PCR檢測三組細胞多能性因子nanog，OCT-4的表達量；用PCR檢測細胞凋亡標志基因caspase-3s，Q-PCR檢測caspase-3的表達，流式細胞儀檢測P3、P15代的hADSC的凋亡；用Q-PCR檢測hADSC成骨分化0d、7d、14d的ALP，collagen type I，OPN，RUNX-2的標志基因的表達量的檢測，細胞在誘導21d時進行茜素紅的染色；hADSC成脂誘導分化14d后進行油紅O染色。 結(jié)果： 1.MTT結(jié)果顯示，hADSC增殖曲線呈S形，增殖情況良好；流式細胞儀檢測表面因子表明CD29、CD44、CD73、CD90和CD105表面標記陽性表達，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR表面標記因子陰性表達；流式細胞儀檢測hADSC細胞周期表明（87.3±0.48）%的細胞處于G1期、（5.3±0.84）%的細胞處于G2期以及（7.4±0.35）%的細胞處于S期；茜素紅S染色，油紅O染色結(jié)果顯示hADSC具有向成骨和成脂分化的能力，符合間充質(zhì)干細胞的基本性質(zhì)。 2.mES的細胞集落呈圓形突起狀生長，球形飽滿，克隆的邊緣光滑且細胞核質(zhì)比高，有較好的折光率。其多能性基因nanog、OCT-4、sox-2高表達。收集該細胞狀態(tài)下的ES細胞培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)液，0.22um的濾器過濾除去其中可能混有的胚胎干細胞。 3.流式細胞儀檢測三組表面標記結(jié)果顯示，經(jīng)CM培養(yǎng)后的ADSC，其陽性表達細胞表面標志CD29，CD44，CD73，CD90，CD105表達量無變化，陰性表達的表面標志CD31，CD45表達量降低，HLA-DR表達量增加；PCR結(jié)果顯示c-kit與Sca-1的表達量均表達，無差異；MTT法檢測細胞增殖速率，40%CM組MTT吸光值顯著高于ADSC組（P=0.0120.05），細胞計數(shù)的結(jié)果顯示CM組的細胞增長速率顯著高于其他兩組，流式細胞儀檢測細胞周期，顯示CM組處于S期的百分數(shù)高于其他兩組，間接顯示CM組細胞增殖速度快；Q-PCR結(jié)果顯示，OCT-4表達量，CM組，ES組表達量顯著高于ADSC組，nanog的表達，CM的表達量顯著高于ES組，ADSC組，結(jié)果表明CM培養(yǎng)液能夠增加hADSC的多能性；PCR結(jié)果顯示Caspase-3的表達量CM組顯著低于ADSC組，P=0.0030.01差異極顯著，流式細胞儀檢測細胞凋亡，顯示CM組的細胞凋亡比率低于ADSC實驗組，說明CM培養(yǎng)液能夠抑制hADSC凋亡；ALP及COL I的表達量，誘導七天時表達量最高，ALP：7d的表達量與0d、14d有顯著性差異，0d、7d、14d組間無差異。COL I：ADSC組CM組，7d與0d、14d有顯著性差異，組間無差異。OPN與RUNX-2是成骨分化晚期表達的基因，誘導14d的ADSC組和ES組OPN及RUNX-2的表達量顯著高于CM組。 結(jié)論： 1.胚胎干細胞條件培養(yǎng)液（ESC-CM）能夠顯著的提高hADSC的增殖速率。并不影響hADSC的細胞性質(zhì)。 2.胚胎干細胞條件培養(yǎng)液（ESC-CM）能夠增加nanog，OCT-4的基因的表達量，增加了hADSC的多能性，并且能夠抑制hADSC的凋亡。 3.在成骨成脂誘導分化中，成骨早期表達的基因組間沒有明顯的差異，但是晚期表達的基因如OPN，RUNX-2表達量，CM組明顯低于其他兩組。但誘導28d的hADSC經(jīng)過茜素紅S染色后，鈣結(jié)節(jié)數(shù)目無明顯的差異，說明CM培養(yǎng)液增加了hADSC的原始性。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329

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本文編號：1230920