本文關(guān)鍵詞：體外長期傳代培養(yǎng)對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞造血支持能力的影響

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【摘要】：研究背景： 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是一類源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的多能干細(xì)胞。目前，研究者們已從骨髓、脂肪、肌肉、滑膜、臍帶、胎盤組織等各種組織中分離獲得MSCs，其中人臍帶來源MSCs（hUC-MSCs）現(xiàn)已成為目前更理想的MSCs來源之一。早期有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs是骨髓造血微環(huán)境重要組成成分，在造血支持中發(fā)揮重要作用，其能夠促進(jìn)HSC植入、重建造血微環(huán)境。此外，MSCs還具有多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)能力等獨特的生物學(xué)特性，因而為其實驗研究以及臨床應(yīng)用提供了重要的前提條件，日益?zhèn)涫軐W(xué)者們的關(guān)注。然而，人體組織MSCs含量較低，目前無法滿足臨床治療應(yīng)用的需求，因此，體外長期傳代培養(yǎng)成為臨床大量應(yīng)用MSCs的必要前提。據(jù)研究報道，體外傳代培養(yǎng)后MSCs生物學(xué)特性會發(fā)生一定改變，而目前關(guān)于長期傳代培養(yǎng)對MSCs造血支持能力影響的研究甚少，因此探究體外長期傳代培養(yǎng)對MSCs造血支持能力的影響有重要意義。 目的： 分離、培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，探究其條件培養(yǎng)基的造血支持能力。同時長期體外傳代培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，比較高、低不同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力的差異，重點比較高、低不同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基造血支持能力的差異，以及存在差異的分子機制。 方法： 收集新生兒臍帶組織，我們采用膠原酶消化法對人臍帶組織進(jìn)行分離，應(yīng)用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的方法純化原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并且在體外進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞長期傳代培養(yǎng)。通過細(xì)胞形態(tài)觀察、免疫熒光標(biāo)記分析細(xì)胞表型以及使用不同的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系檢測其多向分化的能力，鑒定分離提純的細(xì)胞是否為間充質(zhì)干細(xì)胞。應(yīng)用MTT比色法分析比較經(jīng)過長期傳代培養(yǎng)高、低不同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況，，同時用流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)體系下，收集高、低不同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清做為條件培養(yǎng)基，使用條件培養(yǎng)基進(jìn)行造血集落形成實驗。通過real-timePCR檢測高、低不同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞造血相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)量，并應(yīng)用ELISA檢測條件培養(yǎng)基中造血相關(guān)細(xì)胞因子的含量。 結(jié)果： 分離純化獲得的細(xì)胞貼壁生長，呈典型的成纖維細(xì)胞形或紡錘形。流式細(xì)胞術(shù)檢測，其表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166，而CD19、CD31、CD34、CD45、CD106、HLA-DR細(xì)胞表面標(biāo)記為陰性。在誘導(dǎo)分化體系下，細(xì)胞可以向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化。以上結(jié)果證實我們所得到的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠在體外發(fā)揮支持造血的功能，其可支持造血干/祖細(xì)胞主要向除紅細(xì)胞系以外的髓系細(xì)胞分化(CFU-G47.67±0.58、CFU-GM48.67±4.73、CFU-M3.00±2.00)。長期體外傳代培養(yǎng)后，高代次（第30代）的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)略發(fā)生改變，細(xì)胞體積變大。其細(xì)胞周期檢測結(jié)果提示，85%以上細(xì)胞處于G0/G1靜止期。MTT法分析得到的增殖曲線表明，與低代次（第3代）細(xì)胞相比，高代次細(xì)胞的增殖能力顯著下降。但其形成的集落形成單位數(shù)量（251.67±25.27）顯著比低代次細(xì)胞所形成的數(shù)量（60.00±3.61）多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），并且高代次細(xì)胞中造血相關(guān)細(xì)胞因子G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-6等的相對表達(dá)量顯著高于低代次細(xì)胞的表達(dá)量。該結(jié)果證明經(jīng)過長期傳代培養(yǎng)后人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的造血支持能力增強。 結(jié)論： 我們從人臍帶中分離純化獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，其體外培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基單獨作用具有支持造血的能力，促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞向髓系血細(xì)胞分化，而不向紅系和淋巴細(xì)胞分化。經(jīng)過體外標(biāo)準(zhǔn)體系長期傳代培養(yǎng)后，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性存在一定差異，其增殖能力下降；隨著長期傳代次數(shù)的增加，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多種造血相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，使得條件培養(yǎng)基造血支持能力顯著增強。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王丁;CD14~+單核細(xì)胞增強人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號：1224245