本文關鍵詞：白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174、AL-71基因的克隆及AL-71基因的原核表達

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【摘要】：當今,心腦血管性腦血栓疾病對人類健康和生命的威脅日益嚴重,探尋和研發(fā)治療抗血栓的藥物已經(jīng)成為各國醫(yī)療界的研究熱點。近幾年來,雖然抑制血小板活性和溶解血栓的藥物有所發(fā)展,但是這些藥物存在一定的不足如副作用多、療效不顯著、周期長等。因此研發(fā)出更適合臨床應用的抗凝溶栓藥物,仍需不斷探索和研究。 蚊子是多種疾病的傳播媒介如登革熱、乙型腦炎、黃熱病、絲蟲病和瘧疾等,主要分布于東南亞地區(qū)及我國南方大部。當蚊子吸血時唾液便分泌抗凝血物質,這些抗凝血物質不僅可以干擾宿主的免疫反應、凝血反應和炎癥反應以便幫助吸血的順利完成,同時也是一組潛在藥理活性的物質。在哺乳動物中,抗凝血酶主要是由肝細胞分泌,是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族重要成員之一,其對維持凝血和抗凝血之間的動態(tài)平衡具有重要意義。 隨著分子生物學與基因工程技術的迅猛發(fā)展,若能實現(xiàn)在蚊蟲體內提取安全、有效的蛋白酶抑制劑并用于預防、診斷和治療血栓性疾病,必將為人類抗凝溶栓藥物的研發(fā)提供重要的參考依據(jù)。為探索蚊蟲體內抗凝血物質對血栓性疾病的治療的可行性,本研究成功克隆出白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174基因和AL-71基因,并進行AL-71基因的原核表達,為蚊蟲抗凝血物質的進一步研究奠定了基礎。具體研究結果如下： 本試驗成功克隆白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174基因,經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn),序列大小為1383bp。經(jīng)同源性分析,獲得的AL-174基因片段與GenBank中已發(fā)表的AL-174核苷酸序列同源性可達84.26%,氨基酸序列同源性達82.57%,說明AL-174基因序列在蚊種間具有一定的保守性。從系統(tǒng)發(fā)生樹上的位置關系可知：白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174核苷酸序列位于系統(tǒng)發(fā)生樹主干支上,說明該基因與其它蚊種親緣關系較遠。利用生物學分析軟件對AL-174蛋白一級、二級結構進行預測和三級結構同源建模。結果顯示,AL-174蛋白結構中包含大量二硫鍵,α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲,分子內6個半胱氨酸以1-6、2-4、3-5的連接方式形成三對二硫鍵,活性部位均含有保守的組氨酸、絲氨酸和精氨酸,催化結構域的多序列比對表現(xiàn)出較高的相似性,并且催化位點的氨基酸殘基與絲氨酸蛋白酶抑制劑原基因序列基本一致。 本試驗成功克隆白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-71基因,經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn),序列大小為1362bp。經(jīng)同源性分析,獲得的AL-71基因片段與已發(fā)表AL-71基因序列同源性達88.85%,氨基酸序列同源性達90.24%,說明該基因序列在蚊種間具有一定的保守性。系統(tǒng)進化分析表明,白紋伊蚊絲氨酸抗凝AL-71基因序列、原白紋伊蚊絲氨酸抗凝AL-71基因序列和白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174基因序列位于系統(tǒng)發(fā)生樹同一分支上,說明親緣關系較近。利用生物學分析軟件對AL-71蛋白一級、二級結構進行預測和三級結構同源建模,結果顯示,AL-71蛋白結構中同樣包含大量的二硫鍵,α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲,催化結構域的多序列比對表現(xiàn)出較高的相似性,并且催化位點的氨基酸殘基與絲氨酸蛋白酶抑制劑原基因序列基本一致。 本試驗成功構建原核表達載體PET-AL-71,并轉化到表達稀有堿基Rosetta (DE3)表達菌株中,經(jīng)IPTG誘導,SDS-PAGE電泳分析,獲得了分子量大小約為50KD的AL-71蛋白,IPTG終濃度為37℃誘導5h時蛋白的表達量較高。
【學位授予單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R384.1

【參考文獻】

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本文編號：1220096