本文關(guān)鍵詞：白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174、AL-71基因的克隆及AL-71基因的原核表達(dá)

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【摘要】：當(dāng)今,心腦血管性腦血栓疾病對(duì)人類健康和生命的威脅日益嚴(yán)重,探尋和研發(fā)治療抗血栓的藥物已經(jīng)成為各國(guó)醫(yī)療界的研究熱點(diǎn)。近幾年來(lái),雖然抑制血小板活性和溶解血栓的藥物有所發(fā)展,但是這些藥物存在一定的不足如副作用多、療效不顯著、周期長(zhǎng)等。因此研發(fā)出更適合臨床應(yīng)用的抗凝溶栓藥物,仍需不斷探索和研究。 蚊子是多種疾病的傳播媒介如登革熱、乙型腦炎、黃熱病、絲蟲病和瘧疾等,主要分布于東南亞地區(qū)及我國(guó)南方大部。當(dāng)蚊子吸血時(shí)唾液便分泌抗凝血物質(zhì),這些抗凝血物質(zhì)不僅可以干擾宿主的免疫反應(yīng)、凝血反應(yīng)和炎癥反應(yīng)以便幫助吸血的順利完成,同時(shí)也是一組潛在藥理活性的物質(zhì)。在哺乳動(dòng)物中,抗凝血酶主要是由肝細(xì)胞分泌,是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族重要成員之一,其對(duì)維持凝血和抗凝血之間的動(dòng)態(tài)平衡具有重要意義。 隨著分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展,若能實(shí)現(xiàn)在蚊蟲體內(nèi)提取安全、有效的蛋白酶抑制劑并用于預(yù)防、診斷和治療血栓性疾病,必將為人類抗凝溶栓藥物的研發(fā)提供重要的參考依據(jù)。為探索蚊蟲體內(nèi)抗凝血物質(zhì)對(duì)血栓性疾病的治療的可行性,本研究成功克隆出白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174基因和AL-71基因,并進(jìn)行AL-71基因的原核表達(dá),為蚊蟲抗凝血物質(zhì)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下： 本試驗(yàn)成功克隆白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174基因,經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),序列大小為1383bp。經(jīng)同源性分析,獲得的AL-174基因片段與GenBank中已發(fā)表的AL-174核苷酸序列同源性可達(dá)84.26%,氨基酸序列同源性達(dá)82.57%,說(shuō)明AL-174基因序列在蚊種間具有一定的保守性。從系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上的位置關(guān)系可知：白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174核苷酸序列位于系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)主干支上,說(shuō)明該基因與其它蚊種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。利用生物學(xué)分析軟件對(duì)AL-174蛋白一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模。結(jié)果顯示,AL-174蛋白結(jié)構(gòu)中包含大量二硫鍵,α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲,分子內(nèi)6個(gè)半胱氨酸以1-6、2-4、3-5的連接方式形成三對(duì)二硫鍵,活性部位均含有保守的組氨酸、絲氨酸和精氨酸,催化結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)表現(xiàn)出較高的相似性,并且催化位點(diǎn)的氨基酸殘基與絲氨酸蛋白酶抑制劑原基因序列基本一致。 本試驗(yàn)成功克隆白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-71基因,經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),序列大小為1362bp。經(jīng)同源性分析,獲得的AL-71基因片段與已發(fā)表AL-71基因序列同源性達(dá)88.85%,氨基酸序列同源性達(dá)90.24%,說(shuō)明該基因序列在蚊種間具有一定的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,白紋伊蚊絲氨酸抗凝AL-71基因序列、原白紋伊蚊絲氨酸抗凝AL-71基因序列和白紋伊蚊絲氨酸抗凝血AL-174基因序列位于系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)同一分支上,說(shuō)明親緣關(guān)系較近。利用生物學(xué)分析軟件對(duì)AL-71蛋白一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模,結(jié)果顯示,AL-71蛋白結(jié)構(gòu)中同樣包含大量的二硫鍵,α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲,催化結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)表現(xiàn)出較高的相似性,并且催化位點(diǎn)的氨基酸殘基與絲氨酸蛋白酶抑制劑原基因序列基本一致。 本試驗(yàn)成功構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-AL-71,并轉(zhuǎn)化到表達(dá)稀有堿基Rosetta (DE3)表達(dá)菌株中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳分析,獲得了分子量大小約為50KD的AL-71蛋白,IPTG終濃度為37℃誘導(dǎo)5h時(shí)蛋白的表達(dá)量較高。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R384.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1220096