本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲RH株ROP18-ROP12復(fù)合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

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【摘要】：目的構(gòu)建剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)棒狀體蛋白18(ROP18)與ROP12的復(fù)合基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒,并檢驗(yàn)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法重組質(zhì)粒p VAX1-ROP18和p VAX1-ROP12分別經(jīng)Bam HⅠ和XbaⅠ雙酶切,將ROP12基因克隆至p VAX1-ROP18重組質(zhì)粒。經(jīng)菌落PCR、酶切及測(cè)序鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒p VAX1-ROP18-ROP12轉(zhuǎn)染至He La細(xì)胞。同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒組、p VAX1-ROP18轉(zhuǎn)染組和p VAX1-ROP12轉(zhuǎn)染組。提取各組He La細(xì)胞的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,分別進(jìn)行管家基因β-肌動(dòng)蛋白和ROP18-ROP12復(fù)合基因的RT-PCR鑒定;同時(shí),采用間接熒光免疫法和蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測(cè)重組質(zhì)粒p VAX1-ROP18-ROP12瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞后蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果重組質(zhì)粒p VAX1-ROP18-ROP12的菌落PCR電泳顯示在約2 373 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增片段,與預(yù)期大小相符。提取重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ、Bam HⅠ和XbaⅠ單酶切、雙酶切及三酶切鑒定均正確。測(cè)序結(jié)果顯示,p VAX1-ROP18-ROP12重組質(zhì)粒與已發(fā)表的弓形蟲RH株ROP18基因(登錄號(hào)為AM075204.1)序列一致性為100%,與弓形蟲RH株ROP12基因(登錄號(hào)為DQ096559.1)序列一致性為99%。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后各組β-肌動(dòng)蛋白的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為613 bp,與預(yù)期大小相符。p VAX1-ROP18-ROP12轉(zhuǎn)染組的ROP18-ROP12復(fù)合基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2 373 bp,而其他組未見條帶。間接熒光法檢測(cè)顯示,在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的He La細(xì)胞胞漿中觀察到黃綠色熒光,而對(duì)照組無(wú)黃綠色熒光。Western blotting法檢測(cè)顯示,融合蛋白R(shí)OP18-ROP12相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為85 000。結(jié)論構(gòu)建了重組質(zhì)粒p VAX1-ROP18-ROP12,該質(zhì)粒能在真核細(xì)胞中表達(dá)。
【作者單位】： 河北北方學(xué)院病原生物與免疫學(xué)研究所;
【基金】：河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.H2013405091) 河北省高等學(xué)�？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.ZH2012010) 河北北方學(xué)院校級(jí)重大課題(No.ZD201312) Supported by Hebei Province Natural Science Fund(No.H2013405091) the Key Research Projects of Hebei Higher School Science and Technology(No.ZH2012010) the Major Issue of Hebei North University(No.ZD201312)
【分類號(hào)】：R382.5
【正文快照】： (Institute of Pathogen Biology and Immunology,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China)Supported by Hebei Province Natural Science Fund(No.H2013405091),the Key Research Projects of Hebei Higher School Scienceand Technology(No.ZH2012010),and the Ma

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 蔣華,何深一;弓形蟲疫苗研究新進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2004年06期

2 李運(yùn)娜;黃金貴;李建華;宮鵬濤;楊舉;李赫;李淑紅;張西臣;;剛地弓形蟲親環(huán)蛋白基因TgCyP真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2011年04期

3 聶子雄;張念章;胡錢江;陳銳釗;周東輝;袁子國(guó);林瑞慶;朱興全;;弓形蟲棒狀蛋白17基因的克隆與序列分析[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2013年04期

4 曲道峰;韓劍眾;杜愛芳;;剛地弓形蟲Rop18基因的原核表達(dá)及鑒定[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2013年10期

5 Yan-Bo Zeng;Shun-Hai Zhu;Hui Dong;Hong-Yu Han;Lian-Lian Jiang;Quan Wang;Jun Cheng;Qi-Ping Zhao;Wei-Jiao Ma;Bing Huang;;Great efficacy of sulfachloropyrazine-sodium against acute murine toxoplasmosis[J];Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine;2012年01期

6 米東;祁s，

本文編號(hào)：1218714