發(fā)布時間：2017-11-18 23:04

  本文關鍵詞：我國弓形蟲優(yōu)勢基因型蟲株誘導神經(jīng)干細胞C17.2凋亡的機制研究

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【摘要】：目的研究流行于我國的弓形蟲優(yōu)勢基因型（ChineseⅠ型）代表蟲株TgCtwh3對神經(jīng)干細胞凋亡水平的影響以及其分子機制。 方法（1）C17.2神經(jīng)干細胞系的復蘇、培養(yǎng)、鑒定及與GFP-RH株弓形蟲共培養(yǎng)體系的建立。復蘇C17.2細胞，常規(guī)傳代后，用神經(jīng)干細胞特異性標記蛋白Nestin對其進行免疫熒光鑒定。運用transwell培養(yǎng)板，在下室中預先加入已計數(shù)的C17.2細胞，上室中加入GFP-RH株弓形蟲速殖子，共培養(yǎng)不同時間后，，用熒光顯微鏡觀察下室是否有GFP-RH速殖子以檢測共培養(yǎng)系統(tǒng)的濾過效率。（2）與弓形蟲共培養(yǎng)后C17.2細胞凋亡的檢測。根據(jù)實驗安排加入2×104、1×105、5×105個TgCtwh3速殖子，并設立對照組、速殖子熱滅活組及陽性對照組，培養(yǎng)6h、12h、24h后，收集下室C17.2細胞，采用Annexin V-FITC/PI雙染和免疫印跡法檢測細胞凋亡水平和caspase-3的表達。（3）抑制劑預處理后，細胞凋亡水平及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路中相關蛋白的檢測。1mmol/L TUDCA預處理C17.2細胞6h后，在transwell上室中加入5×105個TgCtwh3速殖子，培養(yǎng)24h后收集下室細胞，流式細胞術檢測細胞凋亡水平，免疫印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路中相關蛋白的表達水平。 結果（1）C17.2細胞對神經(jīng)干細胞特異性標志蛋白Nestin呈免疫陽性。Transwell共培養(yǎng)體系中，弓形蟲速殖子無法穿過濾膜進入含C17.2細胞的下室中。（2）C17.2細胞與TgCtwh3株弓形蟲速殖子共培養(yǎng)6h、12h、24h后，細胞凋亡率分別為9.62±1.02%、12.73±0.99%、15.6±1.35%，而此時對照組細胞凋亡水平分別為4.54±1.72%、5.25±1.27%、6.98±1.11%，速殖子熱滅活組的細胞凋亡率分別為4.99±0.54%、6.29±2.08%、7.58±1.16%。以上結果發(fā)現(xiàn)，隨著共培養(yǎng)時間的延長，細胞凋亡水平增加，且與對照組相比存在差異（P＜0.05）。熱滅活組細胞凋亡水平與對照組無差異。（3）C17.2細胞分別與2×104、1×105、5×105個TgCtwh3速殖子共培養(yǎng)24h后，細胞凋亡率分別為7.87±2.01%、11.05±0.77%、14.87±0.96%，與對照組的4.8±1.32%相比存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05），而且隨著速殖子數(shù)量的增多，細胞凋亡水平亦隨之增高。免疫印跡結果顯示，弓形蟲共培養(yǎng)組的caspase3被活化。（4）C17.2細胞與5×105個TgCtwh3速殖子和RH速殖子共培養(yǎng)24h后，凋亡率分別為12.52±0.11%、17.47±0.46%，二組之間有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。（5）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路抑制劑TUDCA對C17.2預處理后，TgCtwh3共培養(yǎng)組和RH共培養(yǎng)組的C17.2細胞凋亡率分別為7.23±0.45%、9.93±0.16%，而TUDCA未處理的TgCtwh3共培養(yǎng)組和RH共培養(yǎng)組的細胞凋亡率分別為12.52±0.11%、17.47±0.46%，相比較發(fā)現(xiàn)，抑制劑預處理降低了細胞的凋亡水平（P＜0.05）。（6）WesternBlot結果顯示，TgCtwh3和RH速殖子共培養(yǎng)組C17.2細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路關鍵蛋白caspase12、CHOP、p-JNK的表達上調(diào)。而TUDCA抑制劑預處理后，上述蛋白的表達明顯下調(diào)（P＜0.05）。 結論（1）中國優(yōu)勢基因型代表蟲株TgCtwh3可通過其排泄分泌抗原誘導C17.2神經(jīng)干細胞系的凋亡，凋亡水平呈時間和劑量依賴性，與RH誘導的凋亡水平相比存在顯著性差異。 （2）TgCtwh3可通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路中caspase12、CHOP、p-JNK蛋白誘導神經(jīng)干細胞C17.2的凋亡。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R382.5

【參考文獻】

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本文編號：1201442