本文關(guān)鍵詞：鞭毛蛋白FliC突變體作為HPV L2多肽抗原載體的初步研究

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【摘要】：目前上市的以HPV主要衣殼蛋白L1為基礎(chǔ)的病毒樣顆粒(VLP)疫苗,主要誘發(fā)型別特異性中和抗體,僅可預(yù)防兩種高危型病毒(HPV 16, HPV 18)感染相關(guān)的約70%的宮頸癌,對其他高危型誘發(fā)的約30%的宮頸癌缺乏有效保護,且.生產(chǎn)成本高。病毒次要衣殼蛋白L2N端區(qū)域(主要集中于aa.13-154區(qū))含有多個交叉中和抗體表位,可誘發(fā)產(chǎn)生廣譜保護反應(yīng),但L2N多肽及表位的免疫原性弱,因此增強L2N的免疫原性,可望提高L2N多肽疫苗的廣譜免疫保護活性。鞭毛蛋白可以通過TLR5通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)的成熟,與抗原蛋白融合后免疫,可顯著增強抗原特異的免疫反應(yīng)及體內(nèi)保護活性。流感病毒臨床實驗發(fā)現(xiàn),全長鞭毛蛋白與HA1的胞外區(qū)融合蛋白雖可有效增強抗原的免疫原性,但個別受試者也出現(xiàn)了肌肉疼痛、發(fā)冷等不良反應(yīng)。研究表明降低鞭毛蛋白自身抗體水平可以顯著減少小鼠血清前炎性因子、血清轉(zhuǎn)氨酶等的產(chǎn)生。鑒于HPV 18 DNA在宮頸癌中檢出率僅次于HPV 16,且HPV 18感染腫瘤死亡率是HPV 16的2.4倍,因此本研究以HPV 18 L2 N多肽作為抗原,對鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FliC進行改造,在保留鞭毛蛋白的保守區(qū),特別是保留TLR5的識別區(qū)域(ND1及CD1)的基礎(chǔ)上,對可刺激產(chǎn)生鞭毛蛋白自身抗體的高變區(qū)(ND2+D3+CD2a+CD2b)進行不同程度的刪除,獲得fliC突變體；然后以此為L2N多肽抗原的載體,在大腸桿菌中表達獲得各種FliC突變體/HPV18 L2 N融合蛋白,然后對其活性進行評價,篩選出免疫刺激活性強且誘發(fā)鞭毛蛋白自身抗體水平低的FliC突變體,用于L2多肽蛋白疫苗的研究。結(jié)果如下：1.采用overlapPCR方法分別獲得了fliC△D3(刪除D3)、fliC△D3CD2a(刪除D3+CD2a)及fliC AD2D3(刪除D2+D3)突變體基因,并將其克隆入pET22b表達載體,獲得了鞭毛蛋白突變基因的原核表達載體。然后將18 L2N (aa.13-154)基因插入至fliC突變體刪除區(qū)域,獲得pET22b-fliC△D3/18 L2N. pET22b-fliC△D3CD2a/18 L2N、pET22b-fliC△D2D3/18 L2N表達載體。2.上述三種fliC突變體/18 L2N融合基因原核表達載體,轉(zhuǎn)化BL21,30℃,0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE 及 Western blot檢測表明三種FliC突變體/18 L2N融合蛋白均主要以包涵體的形式表達。經(jīng)Ni-Sepharose層析、透析復(fù)性及Q-Sepharose HP層析(去除內(nèi)毒素)步驟,獲得三種FliC突變體/18 L2N融合蛋白。SDS-PAGE分析顯示獲得純度均大于90%,鱟試劑凝膠法顯示純化蛋白的內(nèi)毒素含量均低于50 EU/mg; Native-PAGE顯示各融合蛋白均主要以單體形式存在。3.取等摩爾量的三種FliC突變體/18 L2N融合蛋白及18 L2N,小鼠皮下免疫三次,間隔兩周。ELISA結(jié)果顯示,第三次免疫兩周后,三種FliC突變體／18 L2N融合蛋白免疫血清中FliC特異性抗體滴度均較18 L2N組的顯著升高,且FliC△D3/18 L2N免疫組免疫血清中FliC特異性抗體滴度顯著高于FliC△D3CD2a/18 L2N和FliC△D2D3/18 L2N免疫組。FliC△D2D3/18 L2N免疫組與FliC△D3CD2a/18 L2N免疫組小鼠血清中FliC特異性IgG抗體無顯著性差異。4.體重變化觀察發(fā)現(xiàn)18 L2N、FliC△D2D3/18 L2、FliC△D3CD2a/18 L2N免疫組小鼠體重均上升,只有FliC△D3/18 L2N免疫組小鼠在初次免疫后第一天體重下降,到第四天時體重恢復(fù)至與其他三組小鼠體重相近的水平。5.假病毒中和實驗顯示,,FliC△D2D3/18 L2N免疫組和FliC△D3/18 L2N免疫組的HPV 18血清中和抗體滴度均顯著高于18 L2N免疫組。FliC△D3CD2a/18L2N免疫組中和抗體滴度較低,與18 L2N免疫組無顯著性差異。本研究結(jié)果表明FliC△D2D3不僅可以降低鞭毛蛋白ELISA結(jié)合抗體,還可增強18 L2N誘發(fā)中和抗體的能力,提示FliC△D2D3可作為載體,用于HPVL2為基礎(chǔ)的融合蛋白疫苗的研究。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

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