本文關(guān)鍵詞：HBV核心蛋白突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其拮抗IFN-α抗病毒機制的研究

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【摘要】：目的構(gòu)建HBV核心蛋白（HBc）突變體L60V，I97L，S85G重組質(zhì)粒（pEGFP-L60V，pEGFP-I97L，pEGFP-S85G），以探討HBV核心蛋白（HBc）拮抗α干擾素（IFN-）抗病毒活性及其相關(guān)機制。 方法以質(zhì)粒p3.8Ⅱ為模板PCR法擴增HBc基因，與真核細(xì)胞表達載體pEGFP-N1連接構(gòu)建pEGFP-HBc-WT，通過定點突變技術(shù)構(gòu)建HBc突變體融合表達載體pEGFP-L60V，pEGFP-I97L，pEGFP-S85G；應(yīng)用熒光顯微鏡及Western blot技術(shù)進行質(zhì)粒鑒定。 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染人肝胚瘤細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，運用熒光顯微鏡及Western blot法分析其在細(xì)胞中的表達及細(xì)胞亞定位；以RT-PCR及Western blot法檢測JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)分子（STAT1、STAT2、IRF9、SOCS3）及抗病毒蛋白（MxA、PKR、2'，5'-OAS）的表達，并以Western blot技術(shù)分析HepG2細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65亞基的表達。 結(jié)果經(jīng)酶切和測序分析，成功構(gòu)建HBc突變體L60V，I97L，S85G重組質(zhì)粒；將這三種突變體表達質(zhì)粒（pEGFP-L60V，pEGFP-I97L，pEGFP-S85G）分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，以1,000IU/mL IFN-α處理，細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白MxA及JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分子STAT1、STAT2、IRF9等呈低表達，其中轉(zhuǎn)染pEGFP-I97L的HepG2細(xì)胞抗病毒蛋白及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子變化最為顯著，SOCS3呈高表達；pEGFP-L60V，pEGFP-I97L，pEGFP-S85G轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并經(jīng)IFN-α處理后，，NF-κB p65蛋白表達顯著降低。結(jié)論HBc及其突變體（L60V，I97L，S85G等）很可能通過影響JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)分子和抗病毒蛋白的表達從而拮抗IFN-α的抗病毒效應(yīng)；NF-κB及SOCS3可能參與HBc突變體拮抗IFN-α的抗病毒效應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373

【參考文獻】

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1 李嘉,朱理珉,梁樹人,李順天,徐健;乙型肝炎病毒核心區(qū)基因變異與細(xì)胞免疫[J];中華肝臟病雜志;2003年09期

2 Petra Gr

本文編號：1198115