本文關(guān)鍵詞：狂犬病病毒不同毒株的生物學(xué)特性和狂犬病暴露后免疫動(dòng)物模型研究

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒引起的人獸共患病，通常由感染了狂犬病病毒的瘋動(dòng)物咬傷或抓傷而感染人，目前尚無有效的治療方法，死亡率為100%。狂犬病疫苗是控制人和動(dòng)物狂犬病的關(guān)鍵因素之一。目前世界上用于人用及獸用狂犬病疫苗生產(chǎn)的毒株種類較多。對于各毒株的生物學(xué)特性，尤其是其致病性和對細(xì)胞的感染性目前缺乏較為系統(tǒng)的研究。本研究選取2株標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒（CVS、CVS-11）和4株疫苗株（PV、4aG、Flury-LEP、CTN-1）共6株狂犬病病毒固定毒，著重研究這6株固定毒對動(dòng)物的致病性和對細(xì)胞的感染性。實(shí)驗(yàn)以小鼠腦內(nèi)和肌肉途徑接種比較不同毒株的致病性；研究并建立HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)誘導(dǎo)的空斑形成技術(shù)測定病毒空斑形成單位（Plaque-forming Unit，PFU）和細(xì)胞病變感染技術(shù)測定病毒感染滴度（CCID50），并用以比較不同毒株的病毒滴度，空斑實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)同時(shí)在Vero及BHK-21細(xì)胞上進(jìn)行，以確定敏感的細(xì)胞系；實(shí)驗(yàn)同時(shí)以常規(guī)的直接免疫熒光法（Direct ImmunofluorescentAssay，dFA）測定的FFU作為滴度參考值。 結(jié)果顯示不同固定毒株對10-12g小鼠的腦內(nèi)致病力普遍很高，但肌肉毒力普遍降低，相差在3.0-5.0lgLD50之間。用二種新的方法（PFU和CCID50）測定不同毒株的病毒滴度與dFA法測定的結(jié)果比較除個(gè)別株外無明顯差別，如CVS-11、4aG、PV株用三種方法測定的滴度均在7.1-7.9lg之間。 實(shí)驗(yàn)表明用dFA法測定病毒滴度的結(jié)果與小鼠腦內(nèi)測定的結(jié)果有可比性，用以替代小鼠腦內(nèi)法測定疫苗原液內(nèi)病毒滴度是可行的。二種細(xì)胞感染法更適宜采用BHK-21細(xì)胞，二種方法測定的病毒滴度操作簡便，無需貴重儀器和昂貴試劑，可以更廣泛地應(yīng)用于狂犬病病毒和疫苗發(fā)展的研究，，也這為狂犬病病毒致病力研究及疫苗的質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。 本文對金黃地鼠作為狂犬病暴露后免疫動(dòng)物模型的可行性進(jìn)行了研究，比較狂犬病固定毒CVS和CTN-1株對不同日齡地鼠和不同日齡小鼠肌內(nèi)感染后的致病性，以及CVS株感染金黃地鼠后病毒入腦和和抗體應(yīng)答動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示地鼠肌內(nèi)感染病毒后7天左右出現(xiàn)狂犬病臨床癥狀，其引起死亡的致病力較小鼠高（地鼠：6.4-8.0lgLD50/ml，小鼠：3.4-6.5lgLD50/ml），3周齡和8周齡金黃地鼠的敏感性無差異。病毒肌肉感染后約5-6天病毒進(jìn)入腦內(nèi)，用dFA可見腦組織的特異性熒光。感染后6-7天血清內(nèi)開始出現(xiàn)中和抗體。根據(jù)以上特性選用8周齡地鼠作為狂犬病暴露后免疫動(dòng)物模型進(jìn)行疫苗的保護(hù)效果實(shí)驗(yàn)。 以金黃地鼠為動(dòng)物模型，評價(jià)人用狂犬病疫苗、疫苗加PIKA佐劑、減毒活疫苗及人狂犬病免疫球蛋白在暴露后免疫中的保護(hù)效果；研究體液免疫在暴露后免疫中的作用，及其與保護(hù)效果的相關(guān)性。將CVS株稀釋至4.0MICLD50/ml，感染8周齡的雌性金黃地鼠的左腿腓腸肌，6h后給予首次暴露后免疫，按照設(shè)計(jì)的免疫程序依次免疫，觀察記錄動(dòng)物發(fā)病死亡情況。通過心臟穿刺連續(xù)采集給予暴露后免疫及感染對照組的血液，分離血清，RFFIT法測定血清抗體。結(jié)果表明未免疫的感染對照組的死亡率在90%左右，人用狂犬病疫苗的免疫保護(hù)力在70%以上，但疫苗稀釋1-5倍后保護(hù)效果下降至20%-30%。同時(shí)在疫苗與PIKA佐劑相同1:4稀釋后保護(hù)作用可達(dá)50%-90%，在聯(lián)合使用疫苗及免疫球蛋白的條件下暴露后保護(hù)率可達(dá)100%。血清中的抗狂犬病病毒特異性中和抗體的檢測結(jié)果表明暴露后免疫組的血清抗體可在第4天出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)，第5天達(dá)到100%陽轉(zhuǎn)，以后持續(xù)維持較高水平，但未感染的暴露前免疫的動(dòng)物的抗體水平從第4天開始一直較前者低，但是個(gè)體的抗體陽轉(zhuǎn)與最終發(fā)病死亡無相關(guān)性。 本研究的實(shí)驗(yàn)表明金黃地鼠適用于作為狂犬病暴露后免疫的動(dòng)物模型。對疫苗的評價(jià)結(jié)果顯示人用狂犬病疫苗的效價(jià)在暴露后免疫中的保護(hù)作用關(guān)系很大，同時(shí)聯(lián)合使用免疫球蛋白抗體注射至關(guān)重要，PIKA佐劑可以明顯降低疫苗抗原量的同時(shí)提高保護(hù)作用，但暴露后免疫4天以后的抗體水平與保護(hù)作用無明顯相關(guān)，其他免疫機(jī)制在暴露后免疫中的作用有待進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄒劍;俞永新;;狂犬病病毒減毒株的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2012年03期

本文編號：1181455