本文關(guān)鍵詞：從中醫(yī)“圓道”理論探討模擬微重力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及功能的影響

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【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs）因其自身的優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是不久即將被引入臨床治療的最優(yōu)干細(xì)胞，其研究從屬于前景開(kāi)闊的再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前世界上有越來(lái)越多的學(xué)者投身到干細(xì)胞的研究中來(lái)，然而干細(xì)胞在臨床運(yùn)用的低效率與高風(fēng)險(xiǎn)是制約其廣泛運(yùn)用于臨床的瓶頸，如何能從干細(xì)胞本身著手提高干細(xì)胞的分化潛能使其高效安全的運(yùn)用于臨床是擺在研究者面前的難題。 近年來(lái)，隨著航空航天事業(yè)的迅猛發(fā)展，諸多研究人員將研究手段發(fā)展到太空領(lǐng)域，并逐步認(rèn)識(shí)到微重力會(huì)對(duì)生物體的生理功能產(chǎn)生巨大的影響。微重力在細(xì)胞水平的作用也已引起了研究者的廣泛關(guān)注。研究表明諸多細(xì)胞在模擬微重力環(huán)境(simulated microgravity,SMG)下可以呈現(xiàn)一種圓形改變，《內(nèi)經(jīng)》云“蓋有諸內(nèi)者，必形諸外”，細(xì)胞這種形態(tài)的改變必然會(huì)對(duì)其功能行為產(chǎn)生巨大的影響，在中醫(yī)圓道理論的指導(dǎo)下，我們推測(cè)模擬微重力為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供一種平衡、圓融的環(huán)境，這種環(huán)境更有利于干細(xì)胞保持其自身的特性。為了證明此種推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)研究模擬微重力干預(yù)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及增殖、分化、遷移等能力的影響，從而從干細(xì)胞本身著手，為臨床獲得高質(zhì)量、高誘導(dǎo)效率干細(xì)胞提供新的手段，本研究首次以“圓道”理論為指導(dǎo)提出模擬微重力處理這一促進(jìn)干細(xì)胞增殖、分化的新手段，為干細(xì)胞早日應(yīng)用于臨床提供新的思路。 實(shí)驗(yàn)一模擬微重力對(duì)BMSCs形態(tài)的影響 1.目的 研究SMG干預(yù)對(duì)BMSCs形態(tài)及細(xì)胞骨架的影響。 2.方法 BMSCs體外原代分離培養(yǎng)后，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表面抗原鑒定，再將BMSCs隨機(jī)分為正常重力（NG）對(duì)照組與模擬微重力（SMG）48h、72h和120h組，，光學(xué)顯微鏡下觀察各組BMSCs形態(tài)的改變，熒光染色觀察各組細(xì)胞骨架蛋白F-actin的變化。 3.結(jié)果 流式分析結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的BMSCs表達(dá)CD44、CD90陽(yáng)性（陽(yáng)性率分別為94.74%和93.57%），表達(dá)CD34和CD45陰性。光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞在SMG干預(yù)后形態(tài)變圓，隨著SMG處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的寬/長(zhǎng)比值越接近1，這種形態(tài)的圓形改變?cè)赟MG刺激72h時(shí)最明顯，微重力處理時(shí)間延長(zhǎng)至120h與SMG72h相比較，形態(tài)的改變沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鬼筆環(huán)肽染色發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的SMG干預(yù)可使細(xì)胞骨架張力下降，細(xì)胞骨架彌散，使細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)圓形改變，隨著微重力處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞骨架有重組跡象。 4.結(jié)論 BMSCs在SMG干預(yù)后可以呈現(xiàn)形態(tài)的“歸圓”改變，這種形態(tài)的改變是通過(guò)SMG調(diào)整細(xì)胞骨架實(shí)現(xiàn)的。 實(shí)驗(yàn)二模擬微重力對(duì)BMSCs功能的影響 1.目的 研究SMG干預(yù)后形態(tài)改變的BMSCs增殖、凋亡、多潛能分化能力和遷移能力的變化。 2.方法 將三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞隨機(jī)分為NG組和SMG組(72h),研究： 2.1.增殖能力：①BrdU標(biāo)記法檢測(cè)兩組細(xì)胞BrdU陽(yáng)性率。②兩組細(xì)胞在培養(yǎng)0、3、7天后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,觀察細(xì)胞增殖情況。③流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞的凋亡率。 2.2.多潛能分化能力：①Q(mào)uantitative PCR及Western Blotting檢測(cè)干細(xì)胞多潛能標(biāo)志OCT4的表達(dá)。②將兩組細(xì)胞在正常重力下分別進(jìn)行內(nèi)皮方向的誘導(dǎo)分化后,免疫熒光染色及Western Blotting檢測(cè)兩組細(xì)胞VWF及CD31的表達(dá)；脂肪方向的誘導(dǎo)分化后,光鏡下觀察油紅O染色陽(yáng)性表達(dá)率,Western Blotting檢測(cè)PPAR/2在各組細(xì)胞蛋白水平的表達(dá)情況；神經(jīng)方向的誘導(dǎo)分化后,免疫熒光染色及Western Blotting檢測(cè)兩組細(xì)胞MAP2及NF-H的表達(dá)情況。③隨后研究BMSCs在SMG環(huán)境中誘導(dǎo)分化能力的變化：將BMSCs在SMG條件下培養(yǎng)72h后,在SMG環(huán)境中分別進(jìn)行脂肪方向和神經(jīng)方向誘導(dǎo)后,重新檢測(cè)上述相關(guān)指標(biāo)的變化。 2.3.遷移能力：①細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定兩組細(xì)胞劃痕后0h、24h、48h、72h劃痕的寬度。②Western Blotting檢測(cè)兩組細(xì)胞CXCR4的表達(dá)情況。 3.結(jié)果 3.1.增殖能力：①SMG組細(xì)胞BrdU陽(yáng)性率較對(duì)照組增高(P0.05)。②BMSCs生長(zhǎng)曲線顯示,在培養(yǎng)第3天和第7天時(shí),SMG組細(xì)胞數(shù)量均較NG組增多。③流式細(xì)胞術(shù)顯示不同SMG組BMSCs與NG組BMSCs凋亡率無(wú)顯著差異。 3.2.多潛能分化能力:①Q(mào)uantitative PCR和Western Blotting結(jié)果表明OCT4在SMG組細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),SMG72h組升高最明顯。②在正常重力下內(nèi)皮方向的誘導(dǎo)結(jié)果表明：SMG組細(xì)胞VWF和CD31的表達(dá)量均較NG組增高。脂肪方向誘導(dǎo)結(jié)果表明：SMG組油紅O染色陽(yáng)性表達(dá)率(47%)明顯高于NG組(18%),Western Blotting結(jié)果顯示PPARγ2在SMG組的表達(dá)較NG組上調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。神經(jīng)方向誘導(dǎo)結(jié)果表明：SMG組細(xì)胞MAP2和NF-H的表達(dá)量上調(diào)較NG組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③BMSCs在SMG環(huán)境中誘導(dǎo)分化能力的變化：兩組BMSCs在正常重力條件下誘導(dǎo)后,OCT4僅有微量表達(dá),而細(xì)胞在SMG環(huán)境中脂肪方向誘導(dǎo)后,細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性率極低(2%)且PPARy2的表達(dá)量極少,但OCT4表達(dá)較前兩組升高(P0.05)。SMG環(huán)境中神經(jīng)方向誘導(dǎo)后細(xì)胞MAP2及NF-H的表達(dá)量極少,但OCT4表達(dá)增多。 3.3.遷移能力：①細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示與NG組相比,SMG組在劃痕0h、24h、48h、72h后細(xì)胞劃痕距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blotting結(jié)果分析,兩組細(xì)胞CXCR4的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.結(jié)論 4.1.SMG處理可以促進(jìn)BMSCs的增殖,且不會(huì)誘發(fā)凋亡 4.2.模擬微重力處理后形態(tài)“歸圓”的BMSCs多潛能分化能力增強(qiáng),其向內(nèi)皮、脂肪、神經(jīng)方向的分化能力均有所提高,且這種誘導(dǎo)分化能力的提高可能是與微重力環(huán)境促進(jìn)干細(xì)胞更好的保持其未分化的狀態(tài)相關(guān)。 4.3.研究結(jié)果尚未證實(shí)模擬微重力處理可以影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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