本文關鍵詞：HDAC5在小鼠胚胎干細胞胚層分化以及體細胞重編程中的作用

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【摘要】：在再生醫(yī)學中，人們可以通過移植自體或配型相符的異體干細胞的方式來實現修復、替代或再生受損或病變的細胞、組織和器官。另外產生于體細胞重編程的誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）也為干細胞的替代治療,疾病發(fā)病機制的研究和新藥的測試提供了另外一種潛在的資源，同時還可以規(guī)避用胚胎干細胞研究所涉及的倫理問題。 胚胎干細胞（embryonic stem cells, ES cells）和誘導多能干細胞因在模擬及治療人類疾病方面的重大研究意義和廣闊的應用前景而成為近年的研究熱點。越來越多的研究表明，表觀遺傳學修飾對胚胎干細胞多能性狀態(tài)的維持、細胞譜系特異性的決定以及體細胞的重編程都起著至關重要的作用。而且表觀遺傳學中的組蛋白修飾可以控制基因的轉錄激活與抑制，其中乙�；亲顬橹匾男揎椃绞街�。一般來說，核心組蛋白的乙�；皆龈吲c轉錄激活有關，反之則與抑制相關。而維持核心組蛋白乙�；降姆�(wěn)定有賴于組蛋白乙�；福╤istone acetylases, HATs）和去乙�；福╤istone deacetylases, HDACs）活性的平衡。 HDACs作為維持組蛋白乙�；胶獾年P鍵酶，憑借其轉錄抑制作用在介導一系列諸如：生長，死亡，分化，發(fā)育以及免疫反應等生物學事件中起著非常重要的作用。根據與酵母去乙�；傅耐葱躁P系，HDACs被分成4個不同的家族。其中II類HDACs因其表達的組織特異性，而可能參與組織細胞的分化和發(fā)育，多項研究表明該家族成員HDAC5可在肌細胞分化、心肌發(fā)育、血管生成以及免疫反應過程中發(fā)揮重要調控作用。 研究目的： 既然HDAC5參與到細胞的分化以及發(fā)育的調控，那么在胚胎發(fā)育的早期，HDAC5是否就已經參與相關調控了呢？由于ES細胞是對應于體內早期胚胎置入后的外胚層細胞，其分化模擬許多與胚胎發(fā)育有關的事件。因此通過探討HDAC5在ES細胞多能性狀態(tài)的維持以及分化中所起的作用，可以更深入地了解胚胎發(fā)育早期所涉及的一些分子調控機制，為干細胞的應用研究奠定基礎。 另外，iPS細胞因與ES細胞的生物學相似性，而有望成為ES細胞很好的替代物。但是通過體細胞重編程產生iPS細胞的過程需要消除體細胞固有的表觀遺傳學標記并建立新的針對干細胞特征的標記,因此通過探究HDAC5在小鼠體細胞重編程中所起的作用，為早日解決重編程中所面臨的問題提供一些新的思路。 因此本研究分為兩個部分，分別探討HDAC5在ES細胞多能性維持、胚層分化以及體細胞重編程中的作用。 研究方法： 1.檢測HDAC5對小鼠ES細胞自我更新的影響 本部分采用小鼠ES-E14TG2a胚胎干細胞系作為研究模型，首先分別建立HDAC5穩(wěn)定下調和過表達的小鼠ES細胞系，然后通過形態(tài)學觀察、堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，ALP)染色、多能性相關基因的檢測和克隆形成能力的評估來評價HDAC5對ES細胞自我更新能力的影響。 2.檢測HDAC5對小鼠ES細胞胚層分化的影響 分別將下調和上調HDAC5的小鼠ES細胞系進行體外分化（自發(fā)分化形成擬胚體）和體內分化（自發(fā)分化形成畸胎瘤），并通過檢測相關胚層標志基因的表達和觀察胚層分化的組織形態(tài)來評價HDAC5對小鼠ES細胞胚層分化的影響。 3.明確HDAC5在小鼠體細胞重編程中的作用 采用Yamanaka四因子誘導小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）重編程的經典方法，并在誘導起始階段加入HDAC5的shRNA的策略，在誘導結束后檢測形成iPS細胞的效率從而判斷HDAC5對重編程的影響。 4.檢測HDAC5對體細胞重編程中MET期的影響 通過下調HDAC5后檢測MET（Mesenchymal-to-Epithelial Transition，間質—上皮樣細胞的轉化）期標志性基因的表達變化，從而揭示HDAC5參與重編程調控的機制。 實驗結果： 1. HDAC5對小鼠ES細胞自我更新的影響 不管是下調或是上調HDAC5的表達，實驗組和對照組在細胞形態(tài)、堿性磷酸酶染色，多能性相關基因表達以及克隆形成能力方面都沒有差異。 2. HDAC5對小鼠ES細胞胚層分化的影響 通過體內外分化實驗發(fā)現：下調HDAC5促進小鼠ES細胞向中胚層分化，同時抑制其向外胚層的分化，而內胚層不受影響；相反，上調HDAC5促進外胚層分化的同時抑制中胚層的分化，內胚層仍然不受影響。 3. HDAC5在小鼠體細胞重編程中的作用 重編程結束后通過計數堿性磷酸酶染色陽性和GFP陽性的克隆發(fā)現：下調HDAC5后嚴重影響重編程的效率。 4. HDAC5對體細胞重編程過程中MET的影響 檢測MET期標志基因的表達表明：下調HDAC5后上皮樣標志基因的表達受到抑制，，而間質樣標志基因則處于異常激活狀態(tài)。 實驗結論： 1. HDAC5不影響小鼠ES細胞自我更新的維持。 2. HDAC5的表達變化影響小鼠ES細胞的胚層分化。 3. HDAC5是小鼠體細胞重編程所必需的關鍵調控因子。 4. HDAC5通過影響MET參與體細胞重編程的調控。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R321

【參考文獻】

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1 Chia-Lin Wei;;Tackling the epigenome in the pluripotent stem cells[J];遺傳學報;2008年07期

本文編號：1165369