本文關(guān)鍵詞：A2BAR在調(diào)控缺氧誘導(dǎo)腸粘膜屏障損傷中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：背景與目的 腸粘膜屏障是機(jī)體的重要屏障結(jié)構(gòu)，包括機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障和化學(xué)屏障。其中機(jī)械屏障是最重要，也是最基礎(chǔ)的屏障結(jié)構(gòu)。各種急、慢性病理情況，如外科手術(shù)應(yīng)激、戰(zhàn)創(chuàng)傷、燒傷、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)、缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)和全胃腸外營養(yǎng)(total parenteral nutrition, TPN)等均可導(dǎo)致腸粘膜屏障損傷，引發(fā)內(nèi)毒素、細(xì)菌入血，進(jìn)而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，最終導(dǎo)致導(dǎo)致多臟器功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)[1]。盡管目前針對不同病理?xiàng)l件下腸粘膜屏障功能的調(diào)控機(jī)制做了大量研究工作，但在急、慢性病理?xiàng)l件下腸粘膜損傷及損傷后修復(fù)機(jī)制尚未闡明。 腺苷(Adenosine, Ado)是腺嘌呤核苷酸的前體和代謝產(chǎn)物，作為一種神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)，廣泛分布于全身各系統(tǒng)及組織，調(diào)節(jié)著多種重要的生理及病理過程。在炎癥反應(yīng)、凝血過程、I/R或缺氧的條件下，細(xì)胞外腺苷濃度高度聚集，通過激活并結(jié)合細(xì)胞膜上的與G蛋白偶聯(lián)的腺苷受體(Adenosine Receptor, AR)，從而啟動一系列的信號轉(zhuǎn)到過程。目前已發(fā)現(xiàn)AR有4種亞型,并已被成功克隆AR分為A1，A2A, A2B,A3腺苷受體。A1受體與Gi/G0蛋白偶聯(lián)，A3受體與Gi蛋白偶聯(lián)，抑制腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)的活性，減少環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平；A2A、A2B與Gs蛋白偶聯(lián)，激活A(yù)C的活性，增加cAMP的水平。低濃度的腺苷即可激活A(yù)2A受體，而只有較高濃度的腺苷才能激活A(yù)2B受體，提示在生理狀態(tài)下基礎(chǔ)水平的腺苷主要激活A(yù)2A受體，當(dāng)腺苷水平上升超過生理水平或達(dá)到病理水平時A2B受體才被激活[2,3]。 A2B受體(Adenosine A2B receptor, A2BAR)參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理及病理過程，包括活化肥大細(xì)胞、抑制血管平滑肌細(xì)胞的生長、刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長、舒張血管、調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放、調(diào)節(jié)腸道氯離子分泌等[4,5,6,7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，，急性缺血和缺氧條件可以誘發(fā)腸道A2BAR高表達(dá)[9]，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)缺血和缺氧對腸粘膜的損傷后修復(fù)的過程。而在IBD模型中，A2BAR/KO小鼠腸道損傷較WT小鼠輕，且A2BAR通過加強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌IL-6而起到促進(jìn)腸道炎癥作用[10]。對于A2BAR的在急、慢性病理?xiàng)l件中如何參與調(diào)控腸粘膜屏障功能的研究，目前仍不明確。因此，本課題擬建立I/R小鼠模型及體外腸粘膜屏障模型，應(yīng)用蛋白印跡、激光共聚焦、U氏灌流系統(tǒng)、跨上皮電阻測定、RT-PCR等技術(shù)，探討I/R條件下A2BAR的激活及失活對維持腸粘膜屏障功能關(guān)鍵的分子Claudin-1、Occludin、ZO-1等的表達(dá)及結(jié)構(gòu)的變化。并通過U氏灌流系統(tǒng)及跨上皮電阻技術(shù)測定跨上皮電阻（TER），明確I/R條件及缺氧條件下A2BAR的激活與失活對腸粘膜屏障的調(diào)控機(jī)制，為腸粘膜屏障損傷及修復(fù)機(jī)制提供新的思路。 方法 1．建立小鼠腸道I/R損傷模型，通過免疫組織化學(xué)、蛋白印跡、RT-PCR及U氏灌流系統(tǒng)技術(shù)，測定小鼠腸粘膜中A2BAR的表達(dá)；利用阻斷劑PSB1115抑制A2BAR表達(dá)后，觀察Claudin-1、Occludin、ZO-1mRNA、蛋白表達(dá)水平及腸粘膜跨上皮電阻，了解I/R條件下A2BAR的失活如何影響腸粘膜緊密連接蛋白的表達(dá)及腸屏障功能。 2.建立腸上皮細(xì)胞系Caco-2缺氧及A2BAR抑制劑PSB1115干預(yù)模型，通過transwell小室培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞、跨上皮電阻(TER測定技術(shù)，了解缺氧及PSB1115（A2BAR特異性抑制劑）干預(yù)情況下TER的變化情況。通過蛋白印跡、RT-PCR、激光共聚焦技術(shù)，檢測常氧、缺氧及缺氧條件下PSB1115干預(yù)對腸上皮Claudin-1、Occludin、ZO-1表達(dá)及結(jié)構(gòu)的影響。 3.建立腸上皮細(xì)胞系Caco-2模型，采用人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞建立腸上皮細(xì)胞缺氧模型，分為常氧組、常氧加Forskolin（腺苷酸環(huán)化酶激動劑作用）組、缺氧8h組、缺氧8h加SQ22536(腺苷酸環(huán)化酶抑制劑)組；采用cAMP檢測試劑盒，檢測實(shí)驗(yàn)各組缺氧前后cAMP水平的變化； RT-PCR及Western-blot方法分別檢測各組腸上皮緊密連接蛋白claudin-1及occludin mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；檢測各組腸上皮TER的變化情況。探討缺氧條件下環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平的變化對腸黏膜屏障功能的的影響。 主要結(jié)果 1．I/R條件下腸粘膜A2BAR表達(dá)量明顯升高，術(shù)后6h達(dá)到峰值；I/R條件下腸道緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白水平都下降，腸粘膜TER值降低；而A2BAR特異性抑制劑PSB1115干預(yù)后， Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白表達(dá)水平較單純I/R組增多，且腸粘膜TER值升高。 2.單純?nèi)毖蹩梢源踢M(jìn)體外培養(yǎng)腸上皮Caco-2細(xì)胞A2BAR表達(dá)量增加；缺氧引起緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，并且緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，同時上皮細(xì)胞TER明顯降低；而A2BAR特異性抑制劑PSB1115緩解了缺氧條件引起的腸上皮屏障功能損害，腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)增多，且促進(jìn)跨上皮電阻TER恢復(fù)。 3.缺氧條件下cAMP水平升高，抑制cAMP水平可增加腸道緊密連接蛋白claudin-1及occludin mRNA及蛋白水平的表達(dá)；且缺氧條件下cAMP水平的下調(diào)，可以減少缺氧對腸上皮屏障的損傷。 結(jié)論 1、I/R條件下腸粘膜A2BAR表達(dá)明顯增加；Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)降低；腸粘膜跨上皮電阻明顯降低；I/R條件下抑制A2BAR表達(dá)，Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)增多，且促進(jìn)了腸粘膜跨上皮電阻升高。提示I/R條件下A2BAR通過調(diào)控腸上皮間緊密連接蛋白的表達(dá)及功能來影響腸上皮屏障功能。 2.缺氧條件下腸上皮A2BAR表達(dá)明顯增加；缺氧造成Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)降低，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞；同時造成腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻降低。缺氧條件下抑制A2BAR表達(dá)，可以引起緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)增多，緩解了緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，同時腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻TER明顯增高。 3、常氧條件下腸上皮細(xì)胞cAMP表達(dá)較少，缺氧能顯著升高cAMP水平。缺氧條件下利用腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536抑制cAMP水平，可以緩解缺氧引發(fā)的緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin的表達(dá)降低和腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻TER的降低。提示缺氧條件下可以通過抑制細(xì)胞膜上A2BAR表達(dá)來降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，從而可以促進(jìn)缺氧條件下腸上皮間緊密連接蛋白的表達(dá)，從而影響并調(diào)控腸上皮屏障功能。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 呂豪;劉建春;于華;張英;王京;翟麗;;腸道缺血再灌注損傷中CD4~+ T細(xì)胞的激活及其與腸上皮細(xì)胞的相互作用[J];武警醫(yī)學(xué);2007年08期

2 陳立軍,尉承澤,宋旭華,趙立,孟憲鈞;抗內(nèi)毒素單抗下調(diào)膿毒癥小鼠腸上皮細(xì)胞白細(xì)胞介素-1轉(zhuǎn)換酶基因表達(dá)及逆轉(zhuǎn)腸上皮細(xì)胞凋亡的作用[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2003年02期

3 丁連安,黎介壽,李幼生,朱念庭,劉放南,譚力;創(chuàng)傷及內(nèi)毒素對大鼠腸屏障功能的損害[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2004年06期

本文編號：1163634