本文關(guān)鍵詞：IgG介導(dǎo)的被動(dòng)系統(tǒng)性過敏反應(yīng)的啟動(dòng)因素及效應(yīng)機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： IgG免疫復(fù)合物 被動(dòng)系統(tǒng)性過敏反應(yīng) 巨噬細(xì)胞 血小板活化因子

【摘要】：速發(fā)型超敏反應(yīng)是臨床上最為常見的一種超敏反應(yīng),發(fā)生過程可分為致敏階段與發(fā)敏階段。其中,致敏階段是指機(jī)體對(duì)過敏原發(fā)生免疫應(yīng)答,產(chǎn)生針對(duì)該過敏原的特異性抗體,發(fā)敏階段是指過敏原再次進(jìn)入致敏機(jī)體結(jié)合特異性抗體形成免疫復(fù)合物,誘發(fā)效應(yīng)細(xì)胞釋放組胺,白三烯,血小板活化因子,前列腺素等過敏介質(zhì),引起以血管通透性增加,粘液分泌亢進(jìn),平滑肌收縮為特點(diǎn)的系統(tǒng)性或局部功能障礙和組織損傷。目前兩類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵驯粡V泛用于速發(fā)超敏反應(yīng)的研究,分別是主動(dòng)過敏及被動(dòng)過敏模型。前者需要致敏過程,再次進(jìn)入機(jī)體的抗原與機(jī)體主動(dòng)產(chǎn)生的抗體結(jié)合觸發(fā)過敏反應(yīng),而后者的構(gòu)建只需將預(yù)先制備的抗體被動(dòng)輸注給機(jī)體后再給予抗原攻擊,不需要機(jī)體免疫主動(dòng)產(chǎn)生抗體的過程,故操作上相對(duì)簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)周期較短,便于研究發(fā)敏過程的效應(yīng)機(jī)制。 經(jīng)典免疫學(xué)概念中引起Ⅰ型超敏反應(yīng)即過敏癥的抗體主要為IgE,隨著越來越多的IgG型治療性單抗已經(jīng)或者即將進(jìn)入臨床,IgG抗體引發(fā)的速發(fā)型超敏反應(yīng)受到關(guān)注,因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)幾乎所有的治療性單抗均以過敏反應(yīng),尤其是速發(fā)超敏反應(yīng)為主要的副反應(yīng),依抗體的不同其發(fā)生率為0.09-77%,其中尤以過敏性休克最為嚴(yán)重,且危及生命。目前有30余種治療性單抗已經(jīng)FDA批準(zhǔn)使用,另有300余種單抗正在處于臨床實(shí)驗(yàn)(clinical trials)。這就使如何預(yù)防或預(yù)測(cè)IgG型單抗誘發(fā)過敏反應(yīng)成為單抗的篩選與臨床應(yīng)用的重要安全性評(píng)估指標(biāo)之一與亟待解決的問題。目前的實(shí)驗(yàn)研究主要借助被動(dòng)系統(tǒng)性過敏反應(yīng)(Passivesystemic anaphylaxis, PSA)的動(dòng)物模型來模擬這一臨床常見的單抗輸注所致的過敏性休克反應(yīng)。 至今,IgG過敏途徑具體的的啟動(dòng)條件尚不清楚。值得注意的是,并非所有的IgG抗體-抗原復(fù)合物或IgG聚合物均能介導(dǎo)PSA。然而,此前并無報(bào)道明確何種類型的IgG型免疫復(fù)合物可以誘發(fā)PSA,亦未給出這類IgG型免疫復(fù)合物的特征與判斷標(biāo)準(zhǔn)。并且,現(xiàn)有研究大多采用單一的抗原抗體復(fù)合物來誘發(fā)PSA,多采用DNP(二硝基苯),TNP(三硝基苯),青霉素等半抗原而非與臨床關(guān)系密切的天然抗原,且主要關(guān)注于過敏反應(yīng)的效應(yīng)機(jī)制而非過敏反應(yīng)的啟動(dòng)條件。因此,本研究采用由8種天然及重組抗原,27種相應(yīng)抗體組成的36對(duì)IgG抗體-抗原復(fù)合物構(gòu)建小鼠PSA模型,并以五種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來預(yù)測(cè)各個(gè)IgG抗體-抗原復(fù)合物是否能夠介導(dǎo)PSA。 已知,體內(nèi)IgG型免疫復(fù)合物可以結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞表面FcyRIII及FcyRIV,促使靶細(xì)胞釋放以血小板活化因子(PAF)為主的活性介質(zhì),引起血管通透性增加及血壓下降等病理變化。然而,IgG過敏通路的效應(yīng)細(xì)胞尚存巨大爭(zhēng)議,不同的研究所證實(shí)的效應(yīng)細(xì)胞類型主要包括：巨噬細(xì)胞,嗜堿性粒細(xì)胞,單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞�，F(xiàn)有報(bào)道均采用相對(duì)單一的抗原抗體體系誘導(dǎo)系統(tǒng)性過敏反應(yīng),亦采用相對(duì)單一的小鼠品系構(gòu)建被動(dòng)過敏模型,各個(gè)研究報(bào)道所得出的結(jié)論之間相互排斥而不可并存。因此,本研究將采用4種天然及重組抗原,IgG1, IgG2a及IgG2b等亞型抗體所組成的6種抗原抗體復(fù)合物構(gòu)建被動(dòng)過敏模型,并在BalB/c及C57BL/6兩種品系小鼠體內(nèi)觀察各個(gè)細(xì)胞類型在IgG通路過敏反應(yīng)的地位。 在對(duì)IgG過敏途徑效應(yīng)細(xì)胞研究的過程中,我們意外發(fā)現(xiàn)了淋巴細(xì)胞抗原6G (Lymphocyte antigen6G, Ly6G)一種尚未見報(bào)道的可溶性存在形式,并建立了可溶性Ly6G (Soluable Ly6G, sLy6G)的雙夾心ELSIA檢測(cè)體系并對(duì)其功能特性進(jìn)行了初步的研究。需要指出的是,在具體的實(shí)驗(yàn)過程中采用的粒細(xì)胞分化抗原(Granulocyte-differentiation antigen, Grl)抗體anti-Grl能夠識(shí)別淋巴細(xì)胞抗原6C (Lymphocyte antigen6C, Ly6C)及Ly6G的共同表位Grl,其中Ly6C分子量14-17KDa,主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞表面；Ly6G分子量25KDa,主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞表面。 一、特定的IgG免疫復(fù)合物方可啟動(dòng)PSA—可介導(dǎo)過敏反應(yīng)的抗體.抗原復(fù)合物(Anaphylaxis-inducing immune complexes, Ai-ICs)定義的確立 前期工作曾獲得的10株抗雞卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)單抗,并以其中三株單抗(2C2,5G12,6H4)與OVA構(gòu)建了PSA模型。本章工作發(fā)現(xiàn)具有單獨(dú)致敏效應(yīng)的2C2,5G12,6H4與1A6,5B8實(shí)際上只針對(duì)OVA (Sigma A5503)中混有的成分卵粘蛋白(Ovomucoid,OVM)。后續(xù)工作均分別以1001μg上述5株抗OVM抗體(2C2,5G12,6H4,1A6,5B8)和由金伯泉教授惠贈(zèng)的2株OVM抗體(No.7,No.9)致敏,2小時(shí)后再給以10μg OVM攻擊,發(fā)現(xiàn)只有2C2,5G12,6H4這三株抗體單獨(dú)致敏具有致PSA效應(yīng),而使用上述不能與OVM構(gòu)建被動(dòng)過敏模型的4株單抗兩兩組合致敏后再給以O(shè)VM攻擊,發(fā)現(xiàn)No.7+1A6, No.7+5B8, No.7+No.9這三種單抗組合致敏亦具有致PSA效應(yīng),其他三種單抗組合(No.9+1A6, No.9+5B8,1A6+5B8)則不具此效應(yīng)。接下來,使用8種天然及重組蛋白抗原及27株相應(yīng)的單抗所組成的36種IgG抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行PSA模型的驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其中14種IgG抗體-抗原復(fù)合物可以介導(dǎo)PSA,而其余22種IgG抗體-抗原復(fù)合物不具此效應(yīng)。 本章工作采用14種IgG抗體-抗原復(fù)合物成功構(gòu)建了小鼠PSA模型,并證實(shí)僅有部分,而非全部的IgG抗體-抗原復(fù)合物可以介導(dǎo)PSA。因此,本研究把可介導(dǎo)PSA的IgG抗體-抗原復(fù)合物稱為過敏癥誘導(dǎo)復(fù)合物Ai-ICs (anaphylaxis-inducing immune complexes, Ai-ICs),以區(qū)別不能介導(dǎo)PSA的IgG抗體-抗原復(fù)合物即nAi-ICs (Non-anaphylaxis-inducing immune complexes, nAi-ICs)。 二、Ai-ICs特性及其判定標(biāo)準(zhǔn) 本章共采用四種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)確定Ai-ICs的特性及其判定標(biāo)準(zhǔn),旨在為治療性抗體的安全性評(píng)價(jià)提供有效方法與指標(biāo)。 (1)組成Ai-ICs的抗原抗體可在體外構(gòu)成雙夾ELISA:發(fā)現(xiàn)能夠形成Ai-ICs的OVM單抗及其組合均可在體外與OVM形成雙夾心ELISA.經(jīng)過對(duì)36對(duì)IgG抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行雙夾心ELISA的驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)能夠形成Ai-ICs的單抗及其組合均能在體外與其相應(yīng)抗原形成雙夾心ELISA (14/36),而不能在體外形成雙夾心ELISA的IgG抗體-抗原復(fù)合物均不能形成Ai-ICs (17/36),另外,亦有一小部分體外能夠形成雙夾心ELISA的IgG抗體-抗原復(fù)合物不能形成Ai-ICs(5/36),我們?cè)谡闹袑?duì)此現(xiàn)象做了一定的分析。 (2) Native-PAGE:選取部分體外制備的含OVM, HSA, AOPP, HbA2的ICs進(jìn)行Native-PAGE,發(fā)現(xiàn)其中Ai-ICs均可形成低荷質(zhì)比的高分子量條帶,然而,部分能夠形成雙夾心ELISA的]Ai-ICs亦會(huì)出現(xiàn)相似條帶,而不能形成雙夾心ELISA的nAi-ICs則均未出現(xiàn)。 (3)被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)(Passive cutaneous anaphylaxis, PC A):以單抗2C2-OVM確定并優(yōu)化PCA實(shí)驗(yàn)條件,證明36對(duì)IgG抗體-抗原復(fù)合物中Ai-ICs均能介導(dǎo)PCA (14/36),而nAi-ICs均無此效應(yīng)(22/36)。 (4)引發(fā)中性粒細(xì)胞CD16/32表達(dá)下調(diào)：分別給以小鼠或其外周血2C2-OVM復(fù)合物刺激,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外2C2-OVM均可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞CD16/32表達(dá)下調(diào),而且進(jìn)一步證實(shí)2C2-OVM復(fù)合物亦可刺激人外周血中性粒細(xì)胞CD16及CD32表達(dá)下調(diào)。以36對(duì)IgG抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外Ai-ICs刺激均可誘發(fā)中性粒細(xì)胞CD16/32表達(dá)下調(diào)(14/36),而nAi-ICs均無此效應(yīng)(22/36)。 此外,如在抗體篩選或研發(fā)階段可進(jìn)行單抗表位識(shí)別及組合測(cè)定。本部分工作證實(shí)單抗或單抗組合與抗原形成的Ai-ICs需具備識(shí)別多價(jià)抗原表位并形成cross-linking的基本條件,均可形成雙夾心ELISA,于Native-PAGE出現(xiàn)高分子量條帶,介導(dǎo)PCA,并在體內(nèi)外觸發(fā)中性粒細(xì)胞CD16/32表達(dá)下調(diào)。這部分工作可望為治療性單抗研發(fā)及臨床應(yīng)用的安全性評(píng)估提供重要參考與標(biāo)準(zhǔn)。 三、Ai-ICs誘發(fā)PSA的影響因素及IgG過敏途徑機(jī)理的研究 本章研究發(fā)現(xiàn)在IgG抗體存在的條件下,外周血瞬時(shí)抗原濃度影響PSA的發(fā)生及嚴(yán)重程度。具體表現(xiàn)為：給以小鼠靜脈注射OVM后0,10,20分鐘后再給以抗OVM抗體2C2靜脈注射,小鼠PSA的癥狀隨2C2注射時(shí)間的推移而減輕甚至不可觀測(cè)。重組人血紅蛋白zeta鏈(rHb zeta)與OVM相似,其在血漿不穩(wěn)定存在且隨其抗體組合3H9+4D11注射時(shí)間的推移PSA癥狀減輕。然而,在血漿中相對(duì)穩(wěn)定的抗原HSA靜脈注射后0,10,20分鐘再給以抗體組合2E9+3A5注射,并未觀測(cè)到明顯的PSA癥狀程度變化。由此可見,不同的抗原在外周血中清除速率不同可能直接導(dǎo)致其在同一時(shí)間點(diǎn)的抗原濃度不同,進(jìn)而影響被動(dòng)抗體輸入誘發(fā)的PSA發(fā)生及其嚴(yán)重程度。 對(duì)于IgG過敏途徑效應(yīng)機(jī)理的研究主要著眼于對(duì)效應(yīng)細(xì)胞及效應(yīng)分子的探索。通過應(yīng)用特異性抗體Mar-1, anti-Grl,氯化釓(GdCl3),脂質(zhì)體,環(huán)磷酰胺分別清除嗜堿粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核／巨噬細(xì)胞,或阻斷其功能,證明巨噬細(xì)胞是IgG過敏途徑的主要效應(yīng)細(xì)胞,而清除嗜堿性粒細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,單核細(xì)胞等各類血細(xì)胞則對(duì)PSA的發(fā)生與嚴(yán)重程度無明顯影響。 通過應(yīng)用特異性受體拮抗劑CV-3988, Triprolidine,發(fā)現(xiàn)血小板活化因子(Platelet activating factor, PAF)而非組胺是IgG過敏途徑的主要效應(yīng)介質(zhì)。亦證明補(bǔ)體C3基因敲除,脾切除不影響PSA的嚴(yán)重程度,而Syk拮抗劑BAY61-3606可以明顯減輕PSA癥狀,說明IgG過敏途徑不依賴補(bǔ)體C3及脾臟內(nèi)的細(xì)胞,而Syk信號(hào)通路在其中發(fā)揮著重要作用。 四、sLy6G的發(fā)現(xiàn)及檢測(cè)體系的建立本部分工作主要基于對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞功能研究中的一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)：在以毒性脂質(zhì)體清除與GdCl3抑制小鼠體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)小鼠全血中性粒細(xì)胞Grl染色下調(diào),但其表面CDllb及CD16/32的染色不受影響。而體外給以脂質(zhì)體的刺激則不影響全血中性粒細(xì)胞Grl染色,說明體內(nèi)誘導(dǎo)Grl染色下調(diào)的效應(yīng)并非脂質(zhì)體與中性粒細(xì)胞的直接作用引發(fā)。將毒性脂質(zhì)體與對(duì)照脂質(zhì)體處理鼠的外周血混合進(jìn)行Grl染色,發(fā)現(xiàn)混合血中性粒細(xì)胞呈均一化的Grl染色,并未出現(xiàn)高低兩群不同Grl表達(dá)水平的中性粒細(xì)胞。洗去毒性脂質(zhì)體處理鼠全血血漿而單獨(dú)以血細(xì)胞進(jìn)行Grl染色后,發(fā)現(xiàn)其中中性粒細(xì)胞Grl的染色恢復(fù)。上述現(xiàn)象高度提示毒性脂質(zhì)體處理鼠血漿中的某種物質(zhì)阻斷了anti-Gr1與中性粒細(xì)胞表面的Grl結(jié)合。 進(jìn)而,我們采用Dot-blot及Western blot證明了可溶性Ly6G (soluble Ly6G, sLy6)的存在：毒性脂質(zhì)體處理鼠血漿能夠特異結(jié)合anti-Grl抗體,其條帶約在25KDa。高度提示樣品中存在可溶性Ly6G (soluble Ly6G, sLy6)。為能準(zhǔn)確捕獲sLy6G,我們以可結(jié)合Ly6G和Ly6C的anti-Gr1為捕獲抗體,以anti-Ly6G單抗為檢測(cè)抗體成功構(gòu)建了毒性脂質(zhì)體處理鼠血漿中可溶性Ly6G的雙夾心ELISA檢測(cè)體系。 毒性脂質(zhì)體處理鼠血漿與腹腔細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),sLy6G能夠特異地結(jié)合腹腔巨噬細(xì)胞,且其在對(duì)照脂質(zhì)體處理后的小鼠體內(nèi)極不穩(wěn)定,呈現(xiàn)出單核巨噬細(xì)胞依賴性的血漿清除。 綜上,本課題以36對(duì)IgG抗體-抗原復(fù)合物構(gòu)建小鼠PSA模型,并在此基礎(chǔ)上提出了IgG過敏途徑的啟動(dòng)者-Ai-ICs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)：可識(shí)別抗原分子表面多價(jià)表位的單抗或多株單抗混合物,即monoclonal cocktail,均可形成雙夾心ELISA,于Native-PAGE出現(xiàn)高分子量條帶,介導(dǎo)PCA,并在體內(nèi)外觸發(fā)中性粒細(xì)胞CD16/32表達(dá)下調(diào)。上述結(jié)果及其所用方法可望成為未來治療性單抗研發(fā)及臨床應(yīng)用的安全性評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)。在相應(yīng)抗體存在下,Ai-ICs能否觸發(fā)PSA及其嚴(yán)重程度受外周血瞬時(shí)抗原濃度的影響。IgG過敏途徑由Ai-ICs啟動(dòng),以PAJF為主要效應(yīng)介質(zhì),以巨噬細(xì)胞為主要的效應(yīng)細(xì)胞,其發(fā)生過程不依賴全血白細(xì)胞,補(bǔ)體及完整脾臟的參與,而Syk信號(hào)通路在其中發(fā)揮著重要作用。在IgG過敏途徑效應(yīng)細(xì)胞的研究中,發(fā)現(xiàn)了一種目前從未報(bào)道過的中性粒細(xì)胞分化抗原Ly6G的可溶性存在形式并成功建立其雙夾心ELISA檢測(cè)體系。針對(duì)其功能特性的研究初步證實(shí),可溶性Ly6G特異結(jié)合單核巨噬細(xì)胞且在正常小鼠呈現(xiàn)出單核巨噬細(xì)胞依賴的血漿清除。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊艷;ASGM1介導(dǎo)PTX預(yù)處理小鼠發(fā)生過敏樣休克的作用及機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王俊;β-伴大豆球蛋白及其酶解肽對(duì)仔豬腸上皮細(xì)胞完整性的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：1149244