本文關(guān)鍵詞：IgG介導(dǎo)的被動系統(tǒng)性過敏反應(yīng)的啟動因素及效應(yīng)機制研究

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【摘要】：速發(fā)型超敏反應(yīng)是臨床上最為常見的一種超敏反應(yīng),發(fā)生過程可分為致敏階段與發(fā)敏階段。其中,致敏階段是指機體對過敏原發(fā)生免疫應(yīng)答,產(chǎn)生針對該過敏原的特異性抗體,發(fā)敏階段是指過敏原再次進入致敏機體結(jié)合特異性抗體形成免疫復(fù)合物,誘發(fā)效應(yīng)細胞釋放組胺,白三烯,血小板活化因子,前列腺素等過敏介質(zhì),引起以血管通透性增加,粘液分泌亢進,平滑肌收縮為特點的系統(tǒng)性或局部功能障礙和組織損傷。目前兩類動物實驗?zāi)Ｐ鸵驯粡V泛用于速發(fā)超敏反應(yīng)的研究,分別是主動過敏及被動過敏模型。前者需要致敏過程,再次進入機體的抗原與機體主動產(chǎn)生的抗體結(jié)合觸發(fā)過敏反應(yīng),而后者的構(gòu)建只需將預(yù)先制備的抗體被動輸注給機體后再給予抗原攻擊,不需要機體免疫主動產(chǎn)生抗體的過程,故操作上相對簡單,實驗周期較短,便于研究發(fā)敏過程的效應(yīng)機制。 經(jīng)典免疫學(xué)概念中引起Ⅰ型超敏反應(yīng)即過敏癥的抗體主要為IgE,隨著越來越多的IgG型治療性單抗已經(jīng)或者即將進入臨床,IgG抗體引發(fā)的速發(fā)型超敏反應(yīng)受到關(guān)注,因為人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有的治療性單抗均以過敏反應(yīng),尤其是速發(fā)超敏反應(yīng)為主要的副反應(yīng),依抗體的不同其發(fā)生率為0.09-77%,其中尤以過敏性休克最為嚴重,且危及生命。目前有30余種治療性單抗已經(jīng)FDA批準使用,另有300余種單抗正在處于臨床實驗(clinical trials)。這就使如何預(yù)防或預(yù)測IgG型單抗誘發(fā)過敏反應(yīng)成為單抗的篩選與臨床應(yīng)用的重要安全性評估指標之一與亟待解決的問題。目前的實驗研究主要借助被動系統(tǒng)性過敏反應(yīng)(Passivesystemic anaphylaxis, PSA)的動物模型來模擬這一臨床常見的單抗輸注所致的過敏性休克反應(yīng)。 至今,IgG過敏途徑具體的的啟動條件尚不清楚。值得注意的是,并非所有的IgG抗體-抗原復(fù)合物或IgG聚合物均能介導(dǎo)PSA。然而,此前并無報道明確何種類型的IgG型免疫復(fù)合物可以誘發(fā)PSA,亦未給出這類IgG型免疫復(fù)合物的特征與判斷標準。并且,現(xiàn)有研究大多采用單一的抗原抗體復(fù)合物來誘發(fā)PSA,多采用DNP(二硝基苯),TNP(三硝基苯),青霉素等半抗原而非與臨床關(guān)系密切的天然抗原,且主要關(guān)注于過敏反應(yīng)的效應(yīng)機制而非過敏反應(yīng)的啟動條件。因此,本研究采用由8種天然及重組抗原,27種相應(yīng)抗體組成的36對IgG抗體-抗原復(fù)合物構(gòu)建小鼠PSA模型,并以五種體內(nèi)外實驗來預(yù)測各個IgG抗體-抗原復(fù)合物是否能夠介導(dǎo)PSA。 已知,體內(nèi)IgG型免疫復(fù)合物可以結(jié)合效應(yīng)細胞表面FcyRIII及FcyRIV,促使靶細胞釋放以血小板活化因子(PAF)為主的活性介質(zhì),引起血管通透性增加及血壓下降等病理變化。然而,IgG過敏通路的效應(yīng)細胞尚存巨大爭議,不同的研究所證實的效應(yīng)細胞類型主要包括：巨噬細胞,嗜堿性粒細胞,單核細胞及中性粒細胞�，F(xiàn)有報道均采用相對單一的抗原抗體體系誘導(dǎo)系統(tǒng)性過敏反應(yīng),亦采用相對單一的小鼠品系構(gòu)建被動過敏模型,各個研究報道所得出的結(jié)論之間相互排斥而不可并存。因此,本研究將采用4種天然及重組抗原,IgG1, IgG2a及IgG2b等亞型抗體所組成的6種抗原抗體復(fù)合物構(gòu)建被動過敏模型,并在BalB/c及C57BL/6兩種品系小鼠體內(nèi)觀察各個細胞類型在IgG通路過敏反應(yīng)的地位。 在對IgG過敏途徑效應(yīng)細胞研究的過程中,我們意外發(fā)現(xiàn)了淋巴細胞抗原6G (Lymphocyte antigen6G, Ly6G)一種尚未見報道的可溶性存在形式,并建立了可溶性Ly6G (Soluable Ly6G, sLy6G)的雙夾心ELSIA檢測體系并對其功能特性進行了初步的研究。需要指出的是,在具體的實驗過程中采用的粒細胞分化抗原(Granulocyte-differentiation antigen, Grl)抗體anti-Grl能夠識別淋巴細胞抗原6C (Lymphocyte antigen6C, Ly6C)及Ly6G的共同表位Grl,其中Ly6C分子量14-17KDa,主要表達于單核巨噬細胞表面；Ly6G分子量25KDa,主要表達于中性粒細胞表面。 一、特定的IgG免疫復(fù)合物方可啟動PSA—可介導(dǎo)過敏反應(yīng)的抗體.抗原復(fù)合物(Anaphylaxis-inducing immune complexes, Ai-ICs)定義的確立 前期工作曾獲得的10株抗雞卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)單抗,并以其中三株單抗(2C2,5G12,6H4)與OVA構(gòu)建了PSA模型。本章工作發(fā)現(xiàn)具有單獨致敏效應(yīng)的2C2,5G12,6H4與1A6,5B8實際上只針對OVA (Sigma A5503)中混有的成分卵粘蛋白(Ovomucoid,OVM)。后續(xù)工作均分別以1001μg上述5株抗OVM抗體(2C2,5G12,6H4,1A6,5B8)和由金伯泉教授惠贈的2株OVM抗體(No.7,No.9)致敏,2小時后再給以10μg OVM攻擊,發(fā)現(xiàn)只有2C2,5G12,6H4這三株抗體單獨致敏具有致PSA效應(yīng),而使用上述不能與OVM構(gòu)建被動過敏模型的4株單抗兩兩組合致敏后再給以O(shè)VM攻擊,發(fā)現(xiàn)No.7+1A6, No.7+5B8, No.7+No.9這三種單抗組合致敏亦具有致PSA效應(yīng),其他三種單抗組合(No.9+1A6, No.9+5B8,1A6+5B8)則不具此效應(yīng)。接下來,使用8種天然及重組蛋白抗原及27株相應(yīng)的單抗所組成的36種IgG抗體-抗原復(fù)合物進行PSA模型的驗證,發(fā)現(xiàn)其中14種IgG抗體-抗原復(fù)合物可以介導(dǎo)PSA,而其余22種IgG抗體-抗原復(fù)合物不具此效應(yīng)。 本章工作采用14種IgG抗體-抗原復(fù)合物成功構(gòu)建了小鼠PSA模型,并證實僅有部分,而非全部的IgG抗體-抗原復(fù)合物可以介導(dǎo)PSA。因此,本研究把可介導(dǎo)PSA的IgG抗體-抗原復(fù)合物稱為過敏癥誘導(dǎo)復(fù)合物Ai-ICs (anaphylaxis-inducing immune complexes, Ai-ICs),以區(qū)別不能介導(dǎo)PSA的IgG抗體-抗原復(fù)合物即nAi-ICs (Non-anaphylaxis-inducing immune complexes, nAi-ICs)。 二、Ai-ICs特性及其判定標準 本章共采用四種體內(nèi)外實驗確定Ai-ICs的特性及其判定標準,旨在為治療性抗體的安全性評價提供有效方法與指標。 (1)組成Ai-ICs的抗原抗體可在體外構(gòu)成雙夾ELISA:發(fā)現(xiàn)能夠形成Ai-ICs的OVM單抗及其組合均可在體外與OVM形成雙夾心ELISA.經(jīng)過對36對IgG抗體-抗原復(fù)合物進行雙夾心ELISA的驗證,發(fā)現(xiàn)能夠形成Ai-ICs的單抗及其組合均能在體外與其相應(yīng)抗原形成雙夾心ELISA (14/36),而不能在體外形成雙夾心ELISA的IgG抗體-抗原復(fù)合物均不能形成Ai-ICs (17/36),另外,亦有一小部分體外能夠形成雙夾心ELISA的IgG抗體-抗原復(fù)合物不能形成Ai-ICs(5/36),我們在正文中對此現(xiàn)象做了一定的分析。 (2) Native-PAGE:選取部分體外制備的含OVM, HSA, AOPP, HbA2的ICs進行Native-PAGE,發(fā)現(xiàn)其中Ai-ICs均可形成低荷質(zhì)比的高分子量條帶,然而,部分能夠形成雙夾心ELISA的]Ai-ICs亦會出現(xiàn)相似條帶,而不能形成雙夾心ELISA的nAi-ICs則均未出現(xiàn)。 (3)被動皮膚過敏反應(yīng)(Passive cutaneous anaphylaxis, PC A):以單抗2C2-OVM確定并優(yōu)化PCA實驗條件,證明36對IgG抗體-抗原復(fù)合物中Ai-ICs均能介導(dǎo)PCA (14/36),而nAi-ICs均無此效應(yīng)(22/36)。 (4)引發(fā)中性粒細胞CD16/32表達下調(diào)：分別給以小鼠或其外周血2C2-OVM復(fù)合物刺激,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外2C2-OVM均可介導(dǎo)中性粒細胞CD16/32表達下調(diào),而且進一步證實2C2-OVM復(fù)合物亦可刺激人外周血中性粒細胞CD16及CD32表達下調(diào)。以36對IgG抗體-抗原復(fù)合物進行驗證,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外Ai-ICs刺激均可誘發(fā)中性粒細胞CD16/32表達下調(diào)(14/36),而nAi-ICs均無此效應(yīng)(22/36)。 此外,如在抗體篩選或研發(fā)階段可進行單抗表位識別及組合測定。本部分工作證實單抗或單抗組合與抗原形成的Ai-ICs需具備識別多價抗原表位并形成cross-linking的基本條件,均可形成雙夾心ELISA,于Native-PAGE出現(xiàn)高分子量條帶,介導(dǎo)PCA,并在體內(nèi)外觸發(fā)中性粒細胞CD16/32表達下調(diào)。這部分工作可望為治療性單抗研發(fā)及臨床應(yīng)用的安全性評估提供重要參考與標準。 三、Ai-ICs誘發(fā)PSA的影響因素及IgG過敏途徑機理的研究 本章研究發(fā)現(xiàn)在IgG抗體存在的條件下,外周血瞬時抗原濃度影響PSA的發(fā)生及嚴重程度。具體表現(xiàn)為：給以小鼠靜脈注射OVM后0,10,20分鐘后再給以抗OVM抗體2C2靜脈注射,小鼠PSA的癥狀隨2C2注射時間的推移而減輕甚至不可觀測。重組人血紅蛋白zeta鏈(rHb zeta)與OVM相似,其在血漿不穩(wěn)定存在且隨其抗體組合3H9+4D11注射時間的推移PSA癥狀減輕。然而,在血漿中相對穩(wěn)定的抗原HSA靜脈注射后0,10,20分鐘再給以抗體組合2E9+3A5注射,并未觀測到明顯的PSA癥狀程度變化。由此可見,不同的抗原在外周血中清除速率不同可能直接導(dǎo)致其在同一時間點的抗原濃度不同,進而影響被動抗體輸入誘發(fā)的PSA發(fā)生及其嚴重程度。 對于IgG過敏途徑效應(yīng)機理的研究主要著眼于對效應(yīng)細胞及效應(yīng)分子的探索。通過應(yīng)用特異性抗體Mar-1, anti-Grl,氯化釓(GdCl3),脂質(zhì)體,環(huán)磷酰胺分別清除嗜堿粒細胞、中性粒細胞及單核／巨噬細胞,或阻斷其功能,證明巨噬細胞是IgG過敏途徑的主要效應(yīng)細胞,而清除嗜堿性粒細胞,中性粒細胞,單核細胞等各類血細胞則對PSA的發(fā)生與嚴重程度無明顯影響。 通過應(yīng)用特異性受體拮抗劑CV-3988, Triprolidine,發(fā)現(xiàn)血小板活化因子(Platelet activating factor, PAF)而非組胺是IgG過敏途徑的主要效應(yīng)介質(zhì)。亦證明補體C3基因敲除,脾切除不影響PSA的嚴重程度,而Syk拮抗劑BAY61-3606可以明顯減輕PSA癥狀,說明IgG過敏途徑不依賴補體C3及脾臟內(nèi)的細胞,而Syk信號通路在其中發(fā)揮著重要作用。 四、sLy6G的發(fā)現(xiàn)及檢測體系的建立本部分工作主要基于對小鼠單核巨噬細胞功能研究中的一個意外發(fā)現(xiàn)：在以毒性脂質(zhì)體清除與GdCl3抑制小鼠體內(nèi)單核巨噬細胞后,發(fā)現(xiàn)小鼠全血中性粒細胞Grl染色下調(diào),但其表面CDllb及CD16/32的染色不受影響。而體外給以脂質(zhì)體的刺激則不影響全血中性粒細胞Grl染色,說明體內(nèi)誘導(dǎo)Grl染色下調(diào)的效應(yīng)并非脂質(zhì)體與中性粒細胞的直接作用引發(fā)。將毒性脂質(zhì)體與對照脂質(zhì)體處理鼠的外周血混合進行Grl染色,發(fā)現(xiàn)混合血中性粒細胞呈均一化的Grl染色,并未出現(xiàn)高低兩群不同Grl表達水平的中性粒細胞。洗去毒性脂質(zhì)體處理鼠全血血漿而單獨以血細胞進行Grl染色后,發(fā)現(xiàn)其中中性粒細胞Grl的染色恢復(fù)。上述現(xiàn)象高度提示毒性脂質(zhì)體處理鼠血漿中的某種物質(zhì)阻斷了anti-Gr1與中性粒細胞表面的Grl結(jié)合。 進而,我們采用Dot-blot及Western blot證明了可溶性Ly6G (soluble Ly6G, sLy6)的存在：毒性脂質(zhì)體處理鼠血漿能夠特異結(jié)合anti-Grl抗體,其條帶約在25KDa。高度提示樣品中存在可溶性Ly6G (soluble Ly6G, sLy6)。為能準確捕獲sLy6G,我們以可結(jié)合Ly6G和Ly6C的anti-Gr1為捕獲抗體,以anti-Ly6G單抗為檢測抗體成功構(gòu)建了毒性脂質(zhì)體處理鼠血漿中可溶性Ly6G的雙夾心ELISA檢測體系。 毒性脂質(zhì)體處理鼠血漿與腹腔細胞的結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn),sLy6G能夠特異地結(jié)合腹腔巨噬細胞,且其在對照脂質(zhì)體處理后的小鼠體內(nèi)極不穩(wěn)定,呈現(xiàn)出單核巨噬細胞依賴性的血漿清除。 綜上,本課題以36對IgG抗體-抗原復(fù)合物構(gòu)建小鼠PSA模型,并在此基礎(chǔ)上提出了IgG過敏途徑的啟動者-Ai-ICs的鑒定標準：可識別抗原分子表面多價表位的單抗或多株單抗混合物,即monoclonal cocktail,均可形成雙夾心ELISA,于Native-PAGE出現(xiàn)高分子量條帶,介導(dǎo)PCA,并在體內(nèi)外觸發(fā)中性粒細胞CD16/32表達下調(diào)。上述結(jié)果及其所用方法可望成為未來治療性單抗研發(fā)及臨床應(yīng)用的安全性評估的標準。在相應(yīng)抗體存在下,Ai-ICs能否觸發(fā)PSA及其嚴重程度受外周血瞬時抗原濃度的影響。IgG過敏途徑由Ai-ICs啟動,以PAJF為主要效應(yīng)介質(zhì),以巨噬細胞為主要的效應(yīng)細胞,其發(fā)生過程不依賴全血白細胞,補體及完整脾臟的參與,而Syk信號通路在其中發(fā)揮著重要作用。在IgG過敏途徑效應(yīng)細胞的研究中,發(fā)現(xiàn)了一種目前從未報道過的中性粒細胞分化抗原Ly6G的可溶性存在形式并成功建立其雙夾心ELISA檢測體系。針對其功能特性的研究初步證實,可溶性Ly6G特異結(jié)合單核巨噬細胞且在正常小鼠呈現(xiàn)出單核巨噬細胞依賴的血漿清除。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【共引文獻】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊艷;ASGM1介導(dǎo)PTX預(yù)處理小鼠發(fā)生過敏樣休克的作用及機制[D];華中科技大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王俊;β-伴大豆球蛋白及其酶解肽對仔豬腸上皮細胞完整性的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

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本文編號：1149244