本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中H3K27me2的變化

  更多相關(guān)文章： 骨髓源性肝干細(xì)胞 肝細(xì)胞 分化 H3K27me2

【摘要】：骨髓源性肝干細(xì)胞(bone marrow-derived liver stem cell, BMDLSC),指骨髓中擁有肝細(xì)胞分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞,屬于非胚胎來源的成體干細(xì)胞。BMDLSC是肝細(xì)胞在肝外的重要來源,擁有自我更新及分化的多潛能性,可以在特定條件下定向分化為肝細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是全能細(xì)胞,也具有分化為肝細(xì)胞的能力。相比胚胎干細(xì)胞,BMDLSC擁有取材方便、分離較簡(jiǎn)單,易于體外培養(yǎng)、研究成本低、不存在胚胎倫理學(xué)問題等優(yōu)點(diǎn),因而備受關(guān)注。肝干細(xì)胞因自我更新及分化的潛能,在應(yīng)用于肝細(xì)胞再生及肝組織工程方面被寄予厚望,成為了全世界研究的熱點(diǎn)之一。目前大鼠骨髓干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的研究并不少見,但其具體分化調(diào)控機(jī)制仍不明確。 研究表明,表觀遺傳學(xué)在調(diào)控干細(xì)胞的自我更新及分化中起重要作用,與分化、組織再生、衰老、DNA的損傷與修復(fù)、腫瘤發(fā)生均起著不可忽視的作用。表觀遺傳學(xué)包括DNA甲基化、組蛋白修飾及染色體重塑等內(nèi)容,其中組蛋白修飾則包括組蛋白甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、ADP核糖基化,這些修飾以及其組合在時(shí)間和空間上和生物功能之間的關(guān)系,可以作為一種重要的表觀遺傳標(biāo)記或語言,因此被稱為“組蛋白密碼”。其中組蛋白H3修飾變化對(duì)細(xì)胞的分化、發(fā)育的調(diào)節(jié)尤為突出。在胚胎干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),分化過程會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生組蛋白修飾酶,這些酶在動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過程中起到了明顯抑制作用。通過H3K27去甲基化酶的作用,可以減少靶基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K27me2甲基化水平,從而解除對(duì)基因的抑制,增強(qiáng)基因的表達(dá)。有人在對(duì)人胚胎干細(xì)胞分化的研究中發(fā)現(xiàn),H3K27甲基化及H3K4甲基化能夠共同影響轉(zhuǎn)錄因子,在人胚胎干細(xì)胞早期分化過程中其甲基化修飾變化會(huì)通過抑制或激活基因的表達(dá),從而影響分化的進(jìn)行。還有其它相關(guān)研究也證實(shí)了H3K27的甲基化與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)聯(lián)系緊密。Ferrari等人報(bào)道H3K27me2存在于大約70%的總組蛋白H3和染色質(zhì)分布區(qū)域,并通過抑制作用防止細(xì)胞的非特異性表達(dá)的增強(qiáng)。Pasini等人通過去除PcG蛋白能夠顯著減少胚胎干細(xì)胞中H3K27me2的表達(dá),并最終引起許多發(fā)育調(diào)節(jié)基因的上調(diào)。目前骨髓干細(xì)胞的組蛋白修飾變化研究較少,BMDLSC體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的過程中,組蛋白H3K27me2是否也存在著變化,是否也起著調(diào)節(jié)作用,目前尚未見報(bào)道。 本研究將利用免疫磁珠分選法從大鼠骨髓干細(xì)胞中分離純化大鼠BMDLSC,而后通過成熟的誘導(dǎo)方案,在體外誘導(dǎo)BMDLSC定向分化為肝細(xì)胞,分別檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間的細(xì)胞ALB、AFP的mRNA水平,并以Western blot動(dòng)態(tài)觀察分化過程中不同時(shí)間點(diǎn)的H3K27me2的表達(dá)水平,以驗(yàn)證體外誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞可行性,并闡明BMDLSC在體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的過程中組蛋白H3K27me2的變化,為進(jìn)一步了解BMDLSC分化過程中組蛋白修飾的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。 1.材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Vista大鼠,30只,周齡5-6周,體重90-100g,購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,清結(jié)級(jí),生長(zhǎng)于SPF級(jí)條件下。 1.2主要試劑 One-Step RT-PCR半定量檢測(cè)試劑盒(大連TaKaRa), Thy-1標(biāo)記小鼠抗大鼠抗體(美國(guó)biolegend), lineage cell depletion kit(德國(guó)Miltenyi Biotec),肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(美國(guó)PeproTech EC),10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(干粉)(美國(guó)Invitrogen),FITC標(biāo)記山羊抗兔抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),Ant i-Hi stone H3(dimethyl K27,英國(guó)Abcam) 1.3實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1大鼠骨髓單核細(xì)胞的分離與提取 乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠,無菌取脛骨和股骨,剪開兩端骨骺,培養(yǎng)液DMEM/MCDB201反復(fù)沖洗骨髓腔,沖出骨髓細(xì)胞,紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,過30u m濾網(wǎng)成單細(xì)胞懸液。配制密度為1.077kg/L的Percoll液,室溫下以2200r/min離心30min；吸取Percoll分離液表面的白膜層,以DMEM培養(yǎng)液洗滌2次,誘導(dǎo)液重懸。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活力,細(xì)胞活力95%才被使用。收集中間的白膜層細(xì)胞即大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞。 1.3.2骨髓干細(xì)胞的免疫磁珠分選及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 先用lineage cell depletion kit作陰性分選,獲得Lin(-)細(xì)胞。取上一步驟所得的單個(gè)核細(xì)胞在室溫下1500r/min離心10mmin,棄去上清液,用PBS進(jìn)行細(xì)胞重懸,按lineage cell depletion kit說明書以10μl/07加入生物素抗體,單克隆抗原簇CD5.CD45R(B220).CDllb.Gr-1(Ly-6G/C).7-4.Ter119,充分混勻后冰上孵育30mmin,按30μl/07加入PBS,再加入生物素抗體磁珠,充分混勻后,冰上孵育30min。加入PBS洗滌2次,室溫下1500r/min離心10min,棄去上清,PBS重懸細(xì)胞。先用PBS緩沖液沖洗選擇柱1次,后將細(xì)胞懸液加至陰性選擇柱上,于磁場(chǎng)中流過；陽性細(xì)胞保留于柱內(nèi),陰性細(xì)胞收集于離心管中,再用PBS沖洗選擇柱3次,篩選所得陰性細(xì)胞即Lin(-)細(xì)胞。所得Lin(-)細(xì)胞懸液室溫下1500r/min離心10min,棄去上清液,用PBS進(jìn)行細(xì)胞重懸,按照10μl/07加入Thy-1抗體磁珠,充分混勻后,冰上孵育30min,冰上孵育30min。加入PBS洗滌2次,室溫下1500r/mmin離心10min,棄去上清,PBS重懸細(xì)胞。先用PBS緩沖液沖洗選擇柱1次,后將細(xì)胞懸液加至陰性選擇柱上,于磁場(chǎng)中流過；陽性細(xì)胞保留于柱內(nèi),再用PBS沖洗選擇柱3次。將選擇柱子脫離磁場(chǎng)后,加1ml PBS緩沖液,柱塞推出選擇柱中的陽性篩選細(xì)胞,即目標(biāo)細(xì)胞Thy-1(+)Lin(-)BMDLSC.以胰蛋白酶消化免疫磁珠分選后的細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后密度調(diào)整為1.0X106個(gè)/ml,取細(xì)胞懸液,離心后去上清,加入PBS緩沖液,以稀釋比為1：100分別加入熒光標(biāo)記的Thy-1抗體及CD45抗體各10μl,混勻充分后4℃下避光孵育30min,移至流式管,上機(jī)檢測(cè)。 1.3.3BMDLSC的定向誘導(dǎo)與培養(yǎng) 將免疫磁珠分選得到Thy-1(+) Lin (-) BMDLSC以1×105細(xì)胞/ml接種于鋪有25ng/ml的纖連蛋白的6孔板中培養(yǎng)(內(nèi)置蓋玻片)。培養(yǎng)液為高糖DMEM/F12,10%胎牛血清,20mM Hepes (Sigma公司),10-7mol/L地塞米松,青霉素與鏈霉素。細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液為高糖DMEM/F122.5%,25ng/ml肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子,20mmol/L Hepes,1Onmol/L地塞米松,青霉素與鏈霉素進(jìn)行誘導(dǎo)分化,每3d換液1次。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)分化形態(tài)。連續(xù)誘導(dǎo)14d,分別在0d、7d、14d記錄細(xì)胞的典型形態(tài)并留夠充足的樣本。取分離后未進(jìn)行免疫磁珠純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為陰性對(duì)照組。0d組、7d組、14d組、陰性對(duì)照組,每組樣本重復(fù)例數(shù)為5。 1.3.4RT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物白蛋白(albumin, ALB)、甲胎蛋白(Alpha-Fetal Protein, AFP) mRNA 取Od、7d、14d細(xì)胞總RNA,按照說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄取得cDNA, RT-PCR檢測(cè)ALB、AFP的表達(dá)(按照試劑盒的說明所標(biāo)記的方法進(jìn)行)。ALB引物：上游5'atcctgaaccgtctgtgtgt3',下游5'cagttatccttgtcggcagc3'。AFP引物：上游5’gcgcatccatttccttcctt3',下游5'Tctaaacacccatcgccagt3'。實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參照,PCR產(chǎn)物取5μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行,3%瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物片段,比較各期ALB、AFP mRNA的表達(dá)量變化。 1.3.5Western blot檢測(cè)H3K27me2表達(dá)情況 分別收集分化0,7,14天的細(xì)胞,用細(xì)胞裂解液RIPA提取蛋白,并加入適量蛋白上樣緩沖液后沸水浴加熱3-5min,以充分變性樣品蛋白,取20μL蛋白,經(jīng)10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉膜1h,用一抗Anti-Histone H3(trimethyl K27)(1:200)4℃冰箱孵育過夜后,用TBST洗膜3次(10min/每次),然后配合二抗羊抗兔抗體(1：1000),室溫孵育1h后,洗膜3次(10min/每次),最后經(jīng)ECL試劑顯色成像。 1.3.6免疫熒光檢測(cè)H3K27me2表達(dá)情況 取分化0、7、14d的骨髓干細(xì)胞,固定及通透化處理后清洗,含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h；加入H3K27組蛋白甲基化的特異性一抗Anti-Histone H3(dimethyl K27)(1:200)4-C過夜；室溫下用含0.1%Tween-20的PBS漂洗3次；加入二抗山羊抗兔抗體(1:1000,),避光室溫孵育1h；去除二抗山羊抗兔抗體,加入DAPI染色液室溫作用15min以上,用含0.1%Tween-20的PBS漂洗3次,熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。 1.4統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,灰度值比值的計(jì)算采用單因素方差分析,組間差異方差齊時(shí)采用LSD,方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn)方法比較。P值0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.結(jié)果 2.1BMDLSC的形態(tài)變化 密度梯度離心后獲得比較均一的球形單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)磁珠分選后,獲得純化的Thy-1(+) Lin (-) BMDLSC,未貼壁狀態(tài)下細(xì)胞分散良好,橢圓透明,形態(tài)大小均一,未見明顯混雜細(xì)胞或死細(xì)胞。而后光鏡下動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)原代細(xì)胞的貼壁伸展時(shí)間大多在培養(yǎng)后48h內(nèi)。誘導(dǎo)7d時(shí)觀察,細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭型、多邊型,密集排布,有少部分細(xì)胞凋亡漂浮。誘導(dǎo)14d時(shí)觀察,細(xì)胞進(jìn)一步變短,以類圓形、圓梭形為主。 2.2流式細(xì)胞術(shù)示分選后的細(xì)胞表面分子標(biāo)志物純度 流式細(xì)胞儀結(jié)果提示表達(dá)Thy-1細(xì)胞表型的細(xì)胞純度為99.63%,表達(dá)CD45細(xì)胞表型的細(xì)胞純度為0.79%。 2.3不同分化時(shí)間的BMDLSC的ALB、AFP mRNA表達(dá) 在免疫磁珠分選后以RT-PCR檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞ALB mRNA含量,未見明顯條帶。誘導(dǎo)7d時(shí),可檢測(cè)到ALB mRNA表達(dá)明顯增多,電泳條帶顯示清晰。誘導(dǎo)14d, ALB mRNA明顯較7d時(shí)增加明顯,電泳條帶高亮,提示目標(biāo)細(xì)胞BMDLSC ALB mRNA表達(dá)高。以ALB mRNA條帶與內(nèi)參β-actin的灰度值比值為縱坐標(biāo),誘導(dǎo)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖,可見ALB mRNA表達(dá)量整體呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。ALB mRNA灰度值比值示Od、7d、14d兩兩之間差別均有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。檢測(cè)Od目標(biāo)細(xì)胞BMDLSC AFP mRNA含量,未見明顯條帶。誘導(dǎo)7d時(shí),可檢測(cè)到AFP mRNA表達(dá)明顯增加,電泳條帶顯示清晰。誘導(dǎo)14d,AFP mRNA的表達(dá)較誘導(dǎo)7d時(shí)下降,但仍明顯比未誘導(dǎo)AFP mRNA表達(dá)高。以AFP mRNA條帶與內(nèi)參β-actin的灰度值比值為縱坐標(biāo),誘導(dǎo)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖,可見AFP mRNA表達(dá)量整體呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)。AFP mRNA灰度值比值示0d、7d、14d兩兩之間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.4不同分化時(shí)間H3K27me2的表達(dá)水平變化 我們采用Western blot檢測(cè)了H3K27me2的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,經(jīng)分選后未誘導(dǎo)的目標(biāo)細(xì)胞H3K27me2表達(dá)水平極低,誘導(dǎo)7d時(shí)表達(dá)增多。誘導(dǎo)14d,H3K27me2表達(dá)水平明顯較7d時(shí)增加。以H3K27me2與內(nèi)參β-actin的灰度值比值為縱坐標(biāo),誘導(dǎo)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖,可見H3K27me2表達(dá)量整體呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),提示H3K27me2隨著BMDLSC的分化,整體呈明顯上升趨勢(shì),0d、7d、14d組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在免疫熒光圖中,我們看到了與Western blot結(jié)果相似,H3K27me2表達(dá)量呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。 結(jié)論 1.體外誘導(dǎo)骨髓源性肝干細(xì)胞在體外向肝細(xì)胞定向分化的過程中,細(xì)胞內(nèi)H3K27二甲基化的表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì),表明組蛋白H3的修飾參與該細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的調(diào)控。 2.組蛋白修飾中H3K27二甲基化變化很可能是調(diào)控骨髓源性肝干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)或因素。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 齊玲;金宏;丁麗娟;溫娜;唐澤波;狄陽;李蘊(yùn)潛;;CD133免疫磁珠分選腦腫瘤干細(xì)胞及其生物學(xué)特性[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年03期

2 劉往;;甲胎蛋白研究進(jìn)展[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2012年01期

3 秦安成;廖彩仙;王宇;袁杰;黃勇平;廖欣鑫;賴勇強(qiáng);龔祖元;;自體骨髓源性肝干細(xì)胞移植治療肝炎后肝硬化的臨床研究[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年03期

4 胡育海;廖彩仙;廖暉;黎冠宏;袁杰;王宇;;TPO+HGF+IL-3方案對(duì)人骨髓源性肝干細(xì)胞各亞群體外擴(kuò)增的促進(jìn)作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2013年04期

5 王英杰;;生物人工肝:進(jìn)展、難點(diǎn)與發(fā)展方向[J];中國(guó)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育;2010年03期

6 洪苓苓;馬旭東;;組蛋白甲基化修飾的研究進(jìn)展[J];臨床血液學(xué)雜志;2010年01期

7 楊蕊,鄒明強(qiáng);流式細(xì)胞術(shù)的最新進(jìn)展[J];分析測(cè)試學(xué)報(bào);2004年06期

8 張夢(mèng)珂;;表觀遺傳學(xué)簡(jiǎn)介[J];生物學(xué)教學(xué);2013年11期

9 高福來;韓明子;金世柱;胡宗晶;車德馨;;骨髓干細(xì)胞分離技術(shù)的探討[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2010年06期

10 龔雪,劉慧雯;肝干細(xì)胞的來源與移植應(yīng)用[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年26期

，

本文編號(hào)：1146782