本文關鍵詞：大鼠骨髓源性肝干細胞向肝細胞分化過程中H3K27me2的變化

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【摘要】：骨髓源性肝干細胞(bone marrow-derived liver stem cell, BMDLSC),指骨髓中擁有肝細胞分化潛能的間充質干細胞,屬于非胚胎來源的成體干細胞。BMDLSC是肝細胞在肝外的重要來源,擁有自我更新及分化的多潛能性,可以在特定條件下定向分化為肝細胞。胚胎干細胞是全能細胞,也具有分化為肝細胞的能力。相比胚胎干細胞,BMDLSC擁有取材方便、分離較簡單,易于體外培養(yǎng)、研究成本低、不存在胚胎倫理學問題等優(yōu)點,因而備受關注。肝干細胞因自我更新及分化的潛能,在應用于肝細胞再生及肝組織工程方面被寄予厚望,成為了全世界研究的熱點之一。目前大鼠骨髓干細胞體外誘導分化為肝細胞的研究并不少見,但其具體分化調控機制仍不明確。 研究表明,表觀遺傳學在調控干細胞的自我更新及分化中起重要作用,與分化、組織再生、衰老、DNA的損傷與修復、腫瘤發(fā)生均起著不可忽視的作用。表觀遺傳學包括DNA甲基化、組蛋白修飾及染色體重塑等內容,其中組蛋白修飾則包括組蛋白甲基化、乙�；⒎核鼗�、磷酸化、ADP核糖基化,這些修飾以及其組合在時間和空間上和生物功能之間的關系,可以作為一種重要的表觀遺傳標記或語言,因此被稱為“組蛋白密碼”。其中組蛋白H3修飾變化對細胞的分化、發(fā)育的調節(jié)尤為突出。在胚胎干細胞的研究中發(fā)現,分化過程會誘導產生組蛋白修飾酶,這些酶在動態(tài)調節(jié)過程中起到了明顯抑制作用。通過H3K27去甲基化酶的作用,可以減少靶基因啟動子區(qū)的H3K27me2甲基化水平,從而解除對基因的抑制,增強基因的表達。有人在對人胚胎干細胞分化的研究中發(fā)現,H3K27甲基化及H3K4甲基化能夠共同影響轉錄因子,在人胚胎干細胞早期分化過程中其甲基化修飾變化會通過抑制或激活基因的表達,從而影響分化的進行。還有其它相關研究也證實了H3K27的甲基化與轉錄起始位點聯(lián)系緊密。Ferrari等人報道H3K27me2存在于大約70%的總組蛋白H3和染色質分布區(qū)域,并通過抑制作用防止細胞的非特異性表達的增強。Pasini等人通過去除PcG蛋白能夠顯著減少胚胎干細胞中H3K27me2的表達,并最終引起許多發(fā)育調節(jié)基因的上調。目前骨髓干細胞的組蛋白修飾變化研究較少,BMDLSC體外誘導分化為肝細胞的過程中,組蛋白H3K27me2是否也存在著變化,是否也起著調節(jié)作用,目前尚未見報道。 本研究將利用免疫磁珠分選法從大鼠骨髓干細胞中分離純化大鼠BMDLSC,而后通過成熟的誘導方案,在體外誘導BMDLSC定向分化為肝細胞,分別檢測不同誘導時間的細胞ALB、AFP的mRNA水平,并以Western blot動態(tài)觀察分化過程中不同時間點的H3K27me2的表達水平,以驗證體外誘導分化肝細胞可行性,并闡明BMDLSC在體外誘導分化為肝細胞的過程中組蛋白H3K27me2的變化,為進一步了解BMDLSC分化過程中組蛋白修飾的調控機制提供理論依據。 1.材料和方法 1.1實驗動物 雄性Vista大鼠,30只,周齡5-6周,體重90-100g,購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心,清結級,生長于SPF級條件下。 1.2主要試劑 One-Step RT-PCR半定量檢測試劑盒(大連TaKaRa), Thy-1標記小鼠抗大鼠抗體(美國biolegend), lineage cell depletion kit(德國Miltenyi Biotec),肝細胞生長因子(美國PeproTech EC),10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(干粉)(美國Invitrogen),FITC標記山羊抗兔抗體(北京博奧森生物技術有限公司),Ant i-Hi stone H3(dimethyl K27,英國Abcam) 1.3實驗方法 1.3.1大鼠骨髓單核細胞的分離與提取 乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠,無菌取脛骨和股骨,剪開兩端骨骺,培養(yǎng)液DMEM/MCDB201反復沖洗骨髓腔,沖出骨髓細胞,紅細胞裂解液裂解紅細胞,過30u m濾網成單細胞懸液。配制密度為1.077kg/L的Percoll液,室溫下以2200r/min離心30min；吸取Percoll分離液表面的白膜層,以DMEM培養(yǎng)液洗滌2次,誘導液重懸。臺盼藍染色計算細胞活力,細胞活力95%才被使用。收集中間的白膜層細胞即大鼠骨髓單個核細胞。 1.3.2骨髓干細胞的免疫磁珠分選及流式細胞術檢測 先用lineage cell depletion kit作陰性分選,獲得Lin(-)細胞。取上一步驟所得的單個核細胞在室溫下1500r/min離心10mmin,棄去上清液,用PBS進行細胞重懸,按lineage cell depletion kit說明書以10μl/07加入生物素抗體,單克隆抗原簇CD5.CD45R(B220).CDllb.Gr-1(Ly-6G/C).7-4.Ter119,充分混勻后冰上孵育30mmin,按30μl/07加入PBS,再加入生物素抗體磁珠,充分混勻后,冰上孵育30min。加入PBS洗滌2次,室溫下1500r/min離心10min,棄去上清,PBS重懸細胞。先用PBS緩沖液沖洗選擇柱1次,后將細胞懸液加至陰性選擇柱上,于磁場中流過；陽性細胞保留于柱內,陰性細胞收集于離心管中,再用PBS沖洗選擇柱3次,篩選所得陰性細胞即Lin(-)細胞。所得Lin(-)細胞懸液室溫下1500r/min離心10min,棄去上清液,用PBS進行細胞重懸,按照10μl/07加入Thy-1抗體磁珠,充分混勻后,冰上孵育30min,冰上孵育30min。加入PBS洗滌2次,室溫下1500r/mmin離心10min,棄去上清,PBS重懸細胞。先用PBS緩沖液沖洗選擇柱1次,后將細胞懸液加至陰性選擇柱上,于磁場中流過；陽性細胞保留于柱內,再用PBS沖洗選擇柱3次。將選擇柱子脫離磁場后,加1ml PBS緩沖液,柱塞推出選擇柱中的陽性篩選細胞,即目標細胞Thy-1(+)Lin(-)BMDLSC.以胰蛋白酶消化免疫磁珠分選后的細胞,細胞計數后密度調整為1.0X106個/ml,取細胞懸液,離心后去上清,加入PBS緩沖液,以稀釋比為1：100分別加入熒光標記的Thy-1抗體及CD45抗體各10μl,混勻充分后4℃下避光孵育30min,移至流式管,上機檢測。 1.3.3BMDLSC的定向誘導與培養(yǎng) 將免疫磁珠分選得到Thy-1(+) Lin (-) BMDLSC以1×105細胞/ml接種于鋪有25ng/ml的纖連蛋白的6孔板中培養(yǎng)(內置蓋玻片)。培養(yǎng)液為高糖DMEM/F12,10%胎牛血清,20mM Hepes (Sigma公司),10-7mol/L地塞米松,青霉素與鏈霉素。細胞貼壁后更換培養(yǎng)液為高糖DMEM/F122.5%,25ng/ml肝細胞生長因子,20mmol/L Hepes,1Onmol/L地塞米松,青霉素與鏈霉素進行誘導分化,每3d換液1次。觀察細胞生長分化形態(tài)。連續(xù)誘導14d,分別在0d、7d、14d記錄細胞的典型形態(tài)并留夠充足的樣本。取分離后未進行免疫磁珠純化的骨髓間充質干細胞為陰性對照組。0d組、7d組、14d組、陰性對照組,每組樣本重復例數為5。 1.3.4RT-PCR檢測肝細胞特異性標記物白蛋白(albumin, ALB)、甲胎蛋白(Alpha-Fetal Protein, AFP) mRNA 取Od、7d、14d細胞總RNA,按照說明書步驟逆轉錄取得cDNA, RT-PCR檢測ALB、AFP的表達(按照試劑盒的說明所標記的方法進行)。ALB引物：上游5'atcctgaaccgtctgtgtgt3',下游5'cagttatccttgtcggcagc3'。AFP引物：上游5’gcgcatccatttccttcctt3',下游5'Tctaaacacccatcgccagt3'。實驗以β-actin為內參照,PCR產物取5μL反應產物進行,3%瓊脂糖凝膠電泳分析產物片段,比較各期ALB、AFP mRNA的表達量變化。 1.3.5Western blot檢測H3K27me2表達情況 分別收集分化0,7,14天的細胞,用細胞裂解液RIPA提取蛋白,并加入適量蛋白上樣緩沖液后沸水浴加熱3-5min,以充分變性樣品蛋白,取20μL蛋白,經10%SDS-PAGE分離后轉膜。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉膜1h,用一抗Anti-Histone H3(trimethyl K27)(1:200)4℃冰箱孵育過夜后,用TBST洗膜3次(10min/每次),然后配合二抗羊抗兔抗體(1：1000),室溫孵育1h后,洗膜3次(10min/每次),最后經ECL試劑顯色成像。 1.3.6免疫熒光檢測H3K27me2表達情況 取分化0、7、14d的骨髓干細胞,固定及通透化處理后清洗,含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h；加入H3K27組蛋白甲基化的特異性一抗Anti-Histone H3(dimethyl K27)(1:200)4-C過夜；室溫下用含0.1%Tween-20的PBS漂洗3次；加入二抗山羊抗兔抗體(1:1000,),避光室溫孵育1h；去除二抗山羊抗兔抗體,加入DAPI染色液室溫作用15min以上,用含0.1%Tween-20的PBS漂洗3次,熒光顯微鏡進行觀察。 1.4統(tǒng)計分析方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,灰度值比值的計算采用單因素方差分析,組間差異方差齊時采用LSD,方差不齊時采用Dunnett T3檢驗方法比較。P值0.05為差別有統(tǒng)計學意義。 2.結果 2.1BMDLSC的形態(tài)變化 密度梯度離心后獲得比較均一的球形單個核細胞,經磁珠分選后,獲得純化的Thy-1(+) Lin (-) BMDLSC,未貼壁狀態(tài)下細胞分散良好,橢圓透明,形態(tài)大小均一,未見明顯混雜細胞或死細胞。而后光鏡下動態(tài)觀察培養(yǎng),發(fā)現原代細胞的貼壁伸展時間大多在培養(yǎng)后48h內。誘導7d時觀察,細胞呈現長梭型、多邊型,密集排布,有少部分細胞凋亡漂浮。誘導14d時觀察,細胞進一步變短,以類圓形、圓梭形為主。 2.2流式細胞術示分選后的細胞表面分子標志物純度 流式細胞儀結果提示表達Thy-1細胞表型的細胞純度為99.63%,表達CD45細胞表型的細胞純度為0.79%。 2.3不同分化時間的BMDLSC的ALB、AFP mRNA表達 在免疫磁珠分選后以RT-PCR檢測目標細胞ALB mRNA含量,未見明顯條帶。誘導7d時,可檢測到ALB mRNA表達明顯增多,電泳條帶顯示清晰。誘導14d, ALB mRNA明顯較7d時增加明顯,電泳條帶高亮,提示目標細胞BMDLSC ALB mRNA表達高。以ALB mRNA條帶與內參β-actin的灰度值比值為縱坐標,誘導時間為橫坐標作圖,可見ALB mRNA表達量整體呈現遞增趨勢。ALB mRNA灰度值比值示Od、7d、14d兩兩之間差別均有統(tǒng)計意義(P0.05)。檢測Od目標細胞BMDLSC AFP mRNA含量,未見明顯條帶。誘導7d時,可檢測到AFP mRNA表達明顯增加,電泳條帶顯示清晰。誘導14d,AFP mRNA的表達較誘導7d時下降,但仍明顯比未誘導AFP mRNA表達高。以AFP mRNA條帶與內參β-actin的灰度值比值為縱坐標,誘導時間為橫坐標作圖,可見AFP mRNA表達量整體呈現先升高后下降趨勢。AFP mRNA灰度值比值示0d、7d、14d兩兩之間差別均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.4不同分化時間H3K27me2的表達水平變化 我們采用Western blot檢測了H3K27me2的表達水平,結果顯示,經分選后未誘導的目標細胞H3K27me2表達水平極低,誘導7d時表達增多。誘導14d,H3K27me2表達水平明顯較7d時增加。以H3K27me2與內參β-actin的灰度值比值為縱坐標,誘導時間為橫坐標作圖,可見H3K27me2表達量整體呈現遞增趨勢,提示H3K27me2隨著BMDLSC的分化,整體呈明顯上升趨勢,0d、7d、14d組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在免疫熒光圖中,我們看到了與Western blot結果相似,H3K27me2表達量呈現明顯上升趨勢。 結論 1.體外誘導骨髓源性肝干細胞在體外向肝細胞定向分化的過程中,細胞內H3K27二甲基化的表達呈逐漸增強趨勢,表明組蛋白H3的修飾參與該細胞向肝細胞定向分化的調控。 2.組蛋白修飾中H3K27二甲基化變化很可能是調控骨髓源性肝干細胞向肝細胞分化的一個重要環(huán)節(jié)或因素。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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1 齊玲;金宏;丁麗娟;溫娜;唐澤波;狄陽;李蘊潛;;CD133免疫磁珠分選腦腫瘤干細胞及其生物學特性[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2011年03期

2 劉往;;甲胎蛋白研究進展[J];當代醫(yī)學;2012年01期

3 秦安成;廖彩仙;王宇;袁杰;黃勇平;廖欣鑫;賴勇強;龔祖元;;自體骨髓源性肝干細胞移植治療肝炎后肝硬化的臨床研究[J];南方醫(yī)科大學學報;2010年03期

4 胡育海;廖彩仙;廖暉;黎冠宏;袁杰;王宇;;TPO+HGF+IL-3方案對人骨髓源性肝干細胞各亞群體外擴增的促進作用[J];廣東醫(yī)學;2013年04期

5 王英杰;;生物人工肝:進展、難點與發(fā)展方向[J];中國繼續(xù)醫(yī)學教育;2010年03期

6 洪苓苓;馬旭東;;組蛋白甲基化修飾的研究進展[J];臨床血液學雜志;2010年01期

7 楊蕊,鄒明強;流式細胞術的最新進展[J];分析測試學報;2004年06期

8 張夢珂;;表觀遺傳學簡介[J];生物學教學;2013年11期

9 高福來;韓明子;金世柱;胡宗晶;車德馨;;骨髓干細胞分離技術的探討[J];胃腸病學和肝病學雜志;2010年06期

10 龔雪,劉慧雯;肝干細胞的來源與移植應用[J];中國臨床康復;2005年26期

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