本文關(guān)鍵詞：基于HIV-1包膜蛋白gp41近膜端外區(qū)分支抗原肽免疫活性及結(jié)構(gòu)的初步研究

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【摘要】：近年多個研究團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)針對HIV-1gp41近膜外區(qū)（membrane-proximalexternal region, MPER）是誘導(dǎo)產(chǎn)生三個強(qiáng)廣泛中和抗體（broadly neutralizingantibody, bnAbs），，4E10，2F5和Z13表位的主要靶點。MPER是高度保守的色氨酸富集區(qū)，參與病毒感染不同進(jìn)程，尤其在HIV與細(xì)胞的膜融合過程中發(fā)揮重要作用。因此，以MPER為基礎(chǔ)設(shè)計免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生4E10和2F5類廣泛中和抗體對預(yù)防艾滋病，研究治病機(jī)理具有重要意義。 本論文依據(jù)MPER能夠形成三聚體結(jié)構(gòu)域，并且可能為膜融合前構(gòu)象，采用多抗原肽系統(tǒng)（multiple antigen peptide system, MAPs），設(shè)計并合成兩種針對新型四分支肽免疫原，4E10-和2F5-MAP4。鑒于先前研究表明Ⅰ型-turn或α-helical構(gòu)象約束型免疫原不能誘導(dǎo)bnAbs，合成肽免疫原未采用額外化學(xué)約束，以相對剛性的賴氨酸分支為核心和柔性表位為支鏈。并對其抗原性、免疫原性、中和活性及構(gòu)象進(jìn)行表征。 通過HPLC，質(zhì)譜和Tricine-SDS-PAGE等技術(shù)對分支肽免疫原進(jìn)行檢測。電泳結(jié)果顯示條帶純度大于90%，分子量約10kD；HPLC分析進(jìn)一步驗證免疫原的純度；質(zhì)譜分析結(jié)果分子量分別為9687.52Da和10056.20Da，與理論值相符。Western-Blot分析抗原性結(jié)果表明，4E10-或2F5-MAP4可以特異性地與相應(yīng)單克隆抗體4E10-或2F5結(jié)合，具有特異性抗原表位。以上結(jié)果初步證明設(shè)計和合成的多肽免疫原具有抗原性。 ELISA結(jié)果顯示，輔以佐劑（油佐劑），小鼠和豚鼠免疫4E10-和2F5-MAP4分支肽免疫原后，免疫血清可特異性結(jié)合4E10、2F5表位，滴度都可達(dá)103～105。HIV中和活性實驗分析豚鼠血清發(fā)現(xiàn)，與含相應(yīng)表位偶聯(lián)KLH蛋白比較，4E10和2F5-MAP4都具有中和HIV-1的能力。4E10-MAP4免疫混合血清，可以中和我國南方代表性流行HIV-1病毒株BC亞型，C亞型，B亞型和AE亞型。其中，B亞型的中和能力較弱，而BC和AE亞型（S91-2）具有強(qiáng)中和活性。2F5-MAP4混合血清對BC亞型具有強(qiáng)中和活性，而對B亞型，C亞型和AE亞型有一定中和活性。 這些結(jié)果令人興奮，初步證實以MPER為基礎(chǔ)的合成分支肽類免疫原誘導(dǎo)抗HIV-1廣譜中和活性的可行性。但依據(jù)實驗免疫原仍需要進(jìn)一步優(yōu)化，如提高免疫原性，增強(qiáng)中和活性和擴(kuò)寬廣譜性等。優(yōu)化免疫原首先需要了解已有免疫原結(jié)構(gòu)，在原有設(shè)計基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。因此,通過圓二色性、傅里葉紅外色譜分析及結(jié)構(gòu)計算模擬，對4E10-和2F5-MAP4的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。 圓二色性分析表明，分支結(jié)構(gòu)設(shè)計使分子構(gòu)象更加復(fù)雜化，與線性肽比較，由于柔性表位聚集和表位分支鏈間相互作用，4E10-和2F5-MAP4具有典型的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象；而且4E10-和2F5-MAP4中α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)比例隨溶劑極性變化而變化。傅里葉紅外分析也證明了4E10-和2F5-MAP4存在二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象。依據(jù)已發(fā)表HIV-1gp41中MPER相應(yīng)晶體結(jié)構(gòu)，通過Gromacs/DiscoveryStudio等計算模擬模塊，對4E10-和2F5-MAP4的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建和推算。結(jié)果顯示4E10-和2F5-MAP4在溶劑條件下，具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，延長模擬運(yùn)算時間可以使模擬的構(gòu)象更加接近天然狀態(tài)。結(jié)構(gòu)學(xué)研究結(jié)果揭示分支肽二級結(jié)構(gòu)組成可能是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵，可作為免疫原結(jié)構(gòu)的優(yōu)化提供依據(jù) 本論文以基于MPER表位為分支設(shè)計的4E10-和2F5-MAP4，并且可以有效誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生針對HIV-1的廣譜中和抗體。4E10-和2F5-MAP4具有典型的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象，并且可能是誘導(dǎo)廣譜中和抗體的關(guān)鍵。該研究也為分支肽結(jié)構(gòu)表征搭建研究平臺，為分支肽免疫原結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃銀霞,董小平;PrP~C轉(zhuǎn)化成PrP~(Sc)的影響因素研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;2005年03期

本文編號：1143670