本文關鍵詞：病毒及質粒DNA刺激后小鼠肌細胞內IFN-β與PD-L1的表達情況

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【摘要】：目的：疫苗接種用于傳染性疾病的防控已取得了很大的成績。經(jīng)典的疫苗包括減毒活疫苗、滅活疫苗、類毒素和亞單位疫苗。這些疫苗的成功開發(fā)使得許多傳染病得到了有效的控制、預防及治療。但傳統(tǒng)疫苗有缺陷，例如死疫苗滅活不全和活疫苗毒力恢復等缺點，所以人們更希望能夠研制出安全、廉價、含有多種具有保護作用的免疫原，基因疫苗的應運而生為這種疫苗的開發(fā)提供了可能性。 基因疫苗具有多方面的優(yōu)點，比如既可以誘導體液免疫應答又可以誘導細胞免疫應答；沒有死疫苗滅活不全和活疫苗毒力恢復的風險；可編碼多種抗原，從而構成多價疫苗；沒有亞單位疫苗因蛋白純化不夠誘發(fā)異源性免疫應答的風險并且具有設計簡單、制備容易、花費較低、相對穩(wěn)定等等優(yōu)點，同時還有研究表明，基因疫苗不僅可以預防某些傳染病，還可以作為一些治療性疫苗來治療一些復雜難治的疾病，例如病毒性肝炎等。這些優(yōu)點充分的顯示出基因疫苗巨大的潛力和應用價值。但是自從90年代基因疫苗誕生以來至今尚無臨床可用的DNA疫苗可用于疾病的防治，究其原因是DNA疫苗存在免疫保護作用不強的缺點。 為克服DNA疫苗免疫保護差的弱點，我室和國內外眾多研究者采用了多種措施。例如采用不同的接種方式以提高宿主細胞的轉染率；采用調節(jié)轉錄調節(jié)元件以優(yōu)化質粒的方法提高抗原的表達；通過在DNA疫苗接種的同時接種含有編碼樹突狀細胞特異性生長因子FLT3l、GM-CSF等的質粒的方法以求增加局部的抗原提高細胞聚集以提高抗原提呈作用；為了提高其免疫保護作用，而采用了使用不同的載體的方法。但均未達到預期效果。 肌肉注射是DNA疫苗的常用接種方式，但對有關肌細胞在DNA疫苗接種后所誘導的免疫應答過程中作用的清楚了解，有可能為DNA疫苗免疫效果的提高找出新的解決途徑。肌細胞在不同的生理和病理狀態(tài)下可表達多種細胞因子，趨化因子和免疫粘附分子等與免疫應答相關的分子，其中干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質（主要是糖蛋白），是可由多種體細胞和淋巴細胞產生的細胞因子，在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節(jié)免疫功能等多種生物活性。而PD-L1具有負性調節(jié)作用，可能在質粒DNA疫苗作用中使其保護不強起不到免疫的作用。 基于上述考量，本研究以小鼠NOR-10細胞為研究對象，用質粒以及病毒刺激細胞，以觀察小鼠肌細胞內IFN-β及PD-L1的變化情況，以探討其在基因疫苗免疫中的作用及意義。 方法：⑴體外刺激細胞：NOR-10細胞以2×105的密度鋪入到6孔板中，24小時后，用LipofectamineTM2000轉染PCDNA3.0/VP1以及用重組腺病毒（AD/VP1本科室構建）感染細胞，，未處理細胞加新鮮培養(yǎng)基作為正常對照組。⑵Trizol提取細胞總RNA：細胞經(jīng)不同處理細胞后，分別在3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時后提取細胞總RNA，未處理組作為正常細胞對照組，進行Real Time PCR。（3）上述轉染后以及病毒感染后分別收取3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時的上清培養(yǎng)基做IFN-β的ELISA實驗。 結果：（1）用PCDNA3.0/VP1刺激后, Real Time PCR的結果顯示PD-L1的mRNA表達在3小時的時候達到高峰，6小時、12小時、24小時、48小時開始緩慢下降，72小時又達到一個高峰；IFN-β的mRNA表達在3小時、6小時持續(xù)性升高，在12小時達到高峰，24小時、48小時下降，72小時又達到一個高峰；ELISA實驗結果顯示，IFN-β的蛋白表達在6小時開始升高,12小時、24小時達到高峰，48小時開始下降，72小時接近正常水平。（2）用腺病毒感染細胞后，Real Time PCR的結果顯示PD-L1的mRNA表達在3小時、6小時、12小時持續(xù)性升高，在24小時達到高峰,48小時略有下降，72小時達到最高峰；IFN-β的mRNA表達在3小時、6小時、12小時呈現(xiàn)表達抑制，24小時表達較正常細胞略微升高，72小時達到最高；ELISA實驗結果顯示，IFN-β的蛋白表達在3小時、6小時、12小時接近正常細胞水平，24小時開始升高，72小時達到最高峰。 結論:(1)質粒DNA轉染進小鼠肌細胞內后使得小鼠肌細胞內的PD-L1及IFN-β mRNA表達出現(xiàn)波動性的變化；IFN-β蛋白水平的表達出現(xiàn)了與mRNA相關的波動性變化。（2）病毒感染小鼠肌細胞后使得小鼠肌細胞內的PD-L1及IFN-β mRNA的表達出現(xiàn)波動性的變化；IFN-β蛋白水平的表達出現(xiàn)了與mRNA相關的波動性變化。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【共引文獻】

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1 唐力;多普勒超聲檢測胎羊炎癥反應綜合征的實驗研究及機制探討[D];福建醫(yī)科大學;2009年

本文編號：1139942