本文關(guān)鍵詞：病毒及質(zhì)粒DNA刺激后小鼠肌細(xì)胞內(nèi)IFN-β與PD-L1的表達(dá)情況

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【摘要】：目的：疫苗接種用于傳染性疾病的防控已取得了很大的成績。經(jīng)典的疫苗包括減毒活疫苗、滅活疫苗、類毒素和亞單位疫苗。這些疫苗的成功開發(fā)使得許多傳染病得到了有效的控制、預(yù)防及治療。但傳統(tǒng)疫苗有缺陷，例如死疫苗滅活不全和活疫苗毒力恢復(fù)等缺點(diǎn)，所以人們更希望能夠研制出安全、廉價、含有多種具有保護(hù)作用的免疫原，基因疫苗的應(yīng)運(yùn)而生為這種疫苗的開發(fā)提供了可能性。 基因疫苗具有多方面的優(yōu)點(diǎn)，比如既可以誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答又可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；沒有死疫苗滅活不全和活疫苗毒力恢復(fù)的風(fēng)險；可編碼多種抗原，從而構(gòu)成多價疫苗；沒有亞單位疫苗因蛋白純化不夠誘發(fā)異源性免疫應(yīng)答的風(fēng)險并且具有設(shè)計(jì)簡單、制備容易、花費(fèi)較低、相對穩(wěn)定等等優(yōu)點(diǎn)，同時還有研究表明，基因疫苗不僅可以預(yù)防某些傳染病，還可以作為一些治療性疫苗來治療一些復(fù)雜難治的疾病，例如病毒性肝炎等。這些優(yōu)點(diǎn)充分的顯示出基因疫苗巨大的潛力和應(yīng)用價值。但是自從90年代基因疫苗誕生以來至今尚無臨床可用的DNA疫苗可用于疾病的防治，究其原因是DNA疫苗存在免疫保護(hù)作用不強(qiáng)的缺點(diǎn)。 為克服DNA疫苗免疫保護(hù)差的弱點(diǎn)，我室和國內(nèi)外眾多研究者采用了多種措施。例如采用不同的接種方式以提高宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；采用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以優(yōu)化質(zhì)粒的方法提高抗原的表達(dá)；通過在DNA疫苗接種的同時接種含有編碼樹突狀細(xì)胞特異性生長因子FLT3l、GM-CSF等的質(zhì)粒的方法以求增加局部的抗原提高細(xì)胞聚集以提高抗原提呈作用；為了提高其免疫保護(hù)作用，而采用了使用不同的載體的方法。但均未達(dá)到預(yù)期效果。 肌肉注射是DNA疫苗的常用接種方式，但對有關(guān)肌細(xì)胞在DNA疫苗接種后所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程中作用的清楚了解，有可能為DNA疫苗免疫效果的提高找出新的解決途徑。肌細(xì)胞在不同的生理和病理狀態(tài)下可表達(dá)多種細(xì)胞因子，趨化因子和免疫粘附分子等與免疫應(yīng)答相關(guān)的分子，其中干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是可由多種體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。而PD-L1具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可能在質(zhì)粒DNA疫苗作用中使其保護(hù)不強(qiáng)起不到免疫的作用。 基于上述考量，本研究以小鼠NOR-10細(xì)胞為研究對象，用質(zhì)粒以及病毒刺激細(xì)胞，以觀察小鼠肌細(xì)胞內(nèi)IFN-β及PD-L1的變化情況，以探討其在基因疫苗免疫中的作用及意義。 方法：⑴體外刺激細(xì)胞：NOR-10細(xì)胞以2×105的密度鋪入到6孔板中，24小時后，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染PCDNA3.0/VP1以及用重組腺病毒（AD/VP1本科室構(gòu)建）感染細(xì)胞，，未處理細(xì)胞加新鮮培養(yǎng)基作為正常對照組。⑵Trizol提取細(xì)胞總RNA：細(xì)胞經(jīng)不同處理細(xì)胞后，分別在3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時后提取細(xì)胞總RNA，未處理組作為正常細(xì)胞對照組，進(jìn)行Real Time PCR。（3）上述轉(zhuǎn)染后以及病毒感染后分別收取3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時的上清培養(yǎng)基做IFN-β的ELISA實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：（1）用PCDNA3.0/VP1刺激后, Real Time PCR的結(jié)果顯示PD-L1的mRNA表達(dá)在3小時的時候達(dá)到高峰，6小時、12小時、24小時、48小時開始緩慢下降，72小時又達(dá)到一個高峰；IFN-β的mRNA表達(dá)在3小時、6小時持續(xù)性升高，在12小時達(dá)到高峰，24小時、48小時下降，72小時又達(dá)到一個高峰；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IFN-β的蛋白表達(dá)在6小時開始升高,12小時、24小時達(dá)到高峰，48小時開始下降，72小時接近正常水平。（2）用腺病毒感染細(xì)胞后，Real Time PCR的結(jié)果顯示PD-L1的mRNA表達(dá)在3小時、6小時、12小時持續(xù)性升高，在24小時達(dá)到高峰,48小時略有下降，72小時達(dá)到最高峰；IFN-β的mRNA表達(dá)在3小時、6小時、12小時呈現(xiàn)表達(dá)抑制，24小時表達(dá)較正常細(xì)胞略微升高，72小時達(dá)到最高；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IFN-β的蛋白表達(dá)在3小時、6小時、12小時接近正常細(xì)胞水平，24小時開始升高，72小時達(dá)到最高峰。 結(jié)論:(1)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠肌細(xì)胞內(nèi)后使得小鼠肌細(xì)胞內(nèi)的PD-L1及IFN-β mRNA表達(dá)出現(xiàn)波動性的變化；IFN-β蛋白水平的表達(dá)出現(xiàn)了與mRNA相關(guān)的波動性變化。（2）病毒感染小鼠肌細(xì)胞后使得小鼠肌細(xì)胞內(nèi)的PD-L1及IFN-β mRNA的表達(dá)出現(xiàn)波動性的變化；IFN-β蛋白水平的表達(dá)出現(xiàn)了與mRNA相關(guān)的波動性變化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 唐力;多普勒超聲檢測胎羊炎癥反應(yīng)綜合征的實(shí)驗(yàn)研究及機(jī)制探討[D];福建醫(yī)科大學(xué);2009年

本文編號：1139942