本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌中rsmA正調(diào)節(jié)基因的篩選及研究

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【摘要】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerugionsa)是一種機會致病的革蘭氏陰性桿菌,在自然界分布廣泛,可導(dǎo)致免疫力下降的患者的發(fā)病率和死亡率升高,囊性纖維化患者和燒傷患者也極易感染此菌。該菌也是導(dǎo)致醫(yī)院感染的三大病原菌之一,且具有廣泛的耐藥性。 在銅綠假單胞菌中RsmA是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白,它主要是與兩個小的調(diào)節(jié)RNAs即RsmY和RsmZ一起進行作用,進而調(diào)節(jié)一些毒性相關(guān)基因的表達(dá),包括N-�；呓z氨酸內(nèi)酯合成基因lasl和rhll,以及氰化氫和鼠李糖脂生物合成的操縱子。在銅綠假單胞菌與呼吸道上皮細(xì)胞相互作用時,RsmA通過正調(diào)節(jié)毒力相關(guān)的III型分泌系統(tǒng)來促進肌動蛋白解聚、增強細(xì)胞毒性及提高細(xì)菌的抗吞噬作用。RsmA的缺失改變了一些涉及重要毒性的各途徑及體系的相關(guān)基因的表達(dá),包括鐵的攝取,銅綠假單胞菌喹諾酮信號的合成,化合物外排泵的形成以及運動性。急性感染和慢性感染也與RsmA調(diào)節(jié)的一系列基因的表達(dá)有密切聯(lián)系。雖然之前有關(guān)RsmA對下游基因的表達(dá)調(diào)控研究取得了很大的進展,但是RsmA本身的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并未完全清楚,很有必要在基因組水平,對rsmA具有調(diào)節(jié)作用的基因進行篩選和研究。 本課題以rsmA基因表達(dá)為線索,構(gòu)建染色體組上整合有rsmA-luxCDABE報道子的銅綠假單胞菌菌株,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了隨機轉(zhuǎn)座突變體庫,并可通過rsmA-luxCDABE報道子發(fā)光強度的變化來篩選對rsmA基因表達(dá)有影響的轉(zhuǎn)座突變體。經(jīng)過篩選共得到14株正調(diào)節(jié)rsmA表達(dá)的突變體,通過隨機PCR及測序比對,確定轉(zhuǎn)座子的插入位點,最終確定rsmA調(diào)節(jié)基因。對這些轉(zhuǎn)座突變體進行表型測定的結(jié)果表明,細(xì)菌運動性、綠膿菌素、胞外多糖產(chǎn)量等均受到不同程度的調(diào)節(jié)。 研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)座突變體F5的各個表型都發(fā)生了明顯變化,突變體F5被破壞的基因為hemK(PA4664),該基因編碼甲基轉(zhuǎn)移酶。對突變體F5進行互補實驗,結(jié)果表明其表型可恢復(fù)至野生型水平。為了進一步研究該基因的功能及與rsmA的相互作用,構(gòu)建了hemK的敲除突變體PAO(AhemK)。結(jié)果表明,與野生型PAO1相比,突變體PAO(△hemK)的運動能力顯著降低,胞外多糖產(chǎn)量明顯增多,表明HemK可以正調(diào)節(jié)細(xì)菌運動性,負(fù)調(diào)節(jié)胞外多糖產(chǎn)量。突變體[AO(△hemK)的胞外蛋白酶及鼠李糖脂的合成能力沒有明顯變化�；騢emK的缺失導(dǎo)致綠膿菌素的合成喪失,且hemK基因正調(diào)節(jié)phzAl和phzA2。雙組份系統(tǒng)相關(guān)基因rsmY、rsmZ及gacA在PAO(△hemK)中的表達(dá)無明顯變化。HemK可正調(diào)節(jié)III型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因exoS、exoY、exsC及exsD。這些結(jié)果對了解銅綠假單胞菌的致病性及其毒性因子的調(diào)節(jié)機理提供了線索。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378

【參考文獻】

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1 崔欽娜;李芳;邢偉越;遲曉艷;馮志彬;王艷華;葛宜和;劉林德;;銅綠假單胞菌全局調(diào)控因子RsmA的缺失影響2個吩嗪基因簇的表達(dá)[J];微生物學(xué)報;2012年11期

2 余華;光麗霞;何曉梅;盛哈蕾;張克斌;;銅綠假單胞菌集群運動的研究進展[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2010年20期

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本文編號：1137588