本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用消減SELEX技術(shù)篩選乙肝表面抗原特異性核酸適配體

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【摘要】：目的核酸適配體是從人工構(gòu)建的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù)中,利用SELEX技術(shù)篩選出來(lái)的能夠與靶分子高特異性、高親和力結(jié)合的特異性單鏈寡核苷酸序列。核酸適配體具有容易制備、純度高；易于被修飾；靶分子范圍廣；親和力高、特異性好；分子量小、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)造成的可能威脅生命的肝臟感染。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是HBV感染的主要標(biāo)志,也是HBV感染者最早出現(xiàn)的血清學(xué)指標(biāo),對(duì)乙型肝炎的早期診斷具有重要意義。HBV感染早期,患者血中的HBsAg含量極低,用現(xiàn)有的檢測(cè)試劑、檢測(cè)方法可能檢測(cè)不到,導(dǎo)致假陰性結(jié)果,延誤治療時(shí)機(jī)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)HBsAg的特異性核酸適配體進(jìn)行篩選,以達(dá)到為HBsAg特異性核酸適配體運(yùn)用于乙型肝炎臨床早期診斷奠定基礎(chǔ)的目的。 方法本實(shí)驗(yàn)以HBsAg做為靶分子,以環(huán)氧樹(shù)脂做為篩選介質(zhì),采用消減SELEX技術(shù)篩選HBsAg的特異性核酸適配體,同時(shí)采用蛋白質(zhì)-核酸斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)篩得的次級(jí)文庫(kù)進(jìn)行鑒定,觀察其與HBsAg的結(jié)合能力。通過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化獲得單個(gè)克隆,從而將次級(jí)文庫(kù)中的不同序列區(qū)分開(kāi)來(lái)。然后采用蛋白質(zhì)-核酸斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)單個(gè)克隆進(jìn)行鑒定,得到與HBsAg高特異性、高親和力結(jié)合的單鏈DNA(ssDNA),然后對(duì)該ssDNA進(jìn)行測(cè)序并分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)。 結(jié)果(1)經(jīng)過(guò)16輪篩選,獲得了針對(duì)HBsAg的富集文庫(kù),蛋白質(zhì)-核酸斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí),篩到的次級(jí)文庫(kù)與HBsAg良好結(jié)合。(2)轉(zhuǎn)化、克隆后,采用蛋白質(zhì)-核酸斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)H4-1、H4-4、H4-6與HBsAg高特異性、高親和力結(jié)合,測(cè)序后分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功篩得HBsAg的3條特異性核酸適配體,為核酸適配體用于HBsAg的早期微量檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎表面抗原 SELEX技術(shù) 核酸適配體
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-7
• 目錄7-10
• 第一章 緒論10-24
• 1.1 核酸適配體11-13
• 1.1.1 核酸適配體概述11
• 1.1.2 核酸適配體與靶分子的相互作用原理11-12
• 1.1.3 核酸適配體的特點(diǎn)12-13
• 1.2 SELEX技術(shù)13-19
• 1.2.1 SELEX技術(shù)的起源13
• 1.2.2 SELEX技術(shù)的基本原理13-15
• 1.2.3 SELEX技術(shù)的發(fā)展15-19
• 1.3 核酸適配體在臨床診斷中的應(yīng)用19-21
• 1.3.1 雙位點(diǎn)結(jié)合測(cè)定(two-site binding assays)19
• 1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FC)19-20
• 1.3.3 生物傳感器(biosensors)20
• 1.3.4 熒光偏振分析(fluorescence polarization,FP)20
• 1.3.5 分子信標(biāo)(molecular beacon)20
• 1.3.6 毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)20-21
• 1.4 核酸適配體在臨床治療中的應(yīng)用21-23
• 1.4.1 抗病毒治療21
• 1.4.2 抗寄生蟲(chóng)治療21
• 1.4.3 抗腫瘤治療21-22
• 1.4.4 抗凝血治療22
• 1.4.5 抑制血管增生22-23
• 1.5 展望23-24
• 第二章 利用SELEX技術(shù)篩選HBsAg的特異性核酸適配體24-40
• 2.1 前言24-25
• 2.2 材料與儀器25-28
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2.2.2 主要試劑26
• 2.2.3 主要溶液的配制26-28
• 2.2.4 主要儀器28
• 2.3 方法28-34
• 2.3.1 靶分子HBsAg的活性檢測(cè)28
• 2.3.2 HBsAg與篩選介質(zhì)環(huán)氧樹(shù)脂的結(jié)合能力測(cè)定28-29
• 2.3.3 HBsAg特異性核酸適配體的篩選29-32
• 2.3.4 蛋白質(zhì)-核酸斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)鑒定HBsAg-ssDNA復(fù)合物32-34
• 2.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定ssDNA富集程度34
• 2.4 結(jié)果34-38
• 2.4.1 HBsAg的活性檢測(cè)34-35
• 2.4.2 HBsAg與環(huán)氧樹(shù)脂的結(jié)合能力測(cè)定35
• 2.4.3 HBsAg與混合纖維素酯濾膜的結(jié)合能力35-36
• 2.4.4 SELEX篩選后ssDNA富集程度36
• 2.4.5 制備dsDNA模板的最佳循環(huán)數(shù)36
• 2.4.6 制備ssDNA的最佳循環(huán)數(shù)36-37
• 2.4.7 ssDNA~(-b)上生物素的活性37
• 2.4.8 次級(jí)文庫(kù)蛋白質(zhì)-核酸斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)37-38
• 2.4.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定ssDNA富集程度38
• 2.5 討論38-40
• 第三章 HBsAg特異性核酸適配體的克隆、鑒定和測(cè)序40-49
• 3.1 材料與儀器40-41
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料40
• 3.1.2 主要試劑的配制40
• 3.1.3 主要溶液的配制40-41
• 3.1.4 主要儀器41
• 3.2 方法41-45
• 3.2.1 次級(jí)文庫(kù)寡核苷酸的克隆41-43
• 3.2.2 通用引物和特異引物交錯(cuò)PCR鑒定陽(yáng)性克隆43-44
• 3.2.3 蛋白質(zhì)-核酸斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)篩選與HBsAg結(jié)合的核酸適配體44-45
• 3.2.4 測(cè)序及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)45
• 3.3 結(jié)果45-48
• 3.3.1 陽(yáng)性克隆的鑒定45
• 3.3.2 陽(yáng)性克隆ssDNA~(-b)的制備45-47
• 3.3.3 陽(yáng)性克隆蛋白質(zhì)-核酸斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)47
• 3.3.4 HBsAg特異性核酸適配體序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu)47-48
• 3.4 討論48
• 3.5 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 在學(xué)期間的研究成果54-55
• 致謝55

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 夏夢(mèng)翎;β-環(huán)糊精的改性及在核酸純化中的應(yīng)用[D];中南民族大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：1134951