本文關(guān)鍵詞：柯薩奇病毒A組16型VP1蛋白原核表達(dá)、純化及鑒定

  更多相關(guān)文章： 柯薩奇病毒A組 16型 VP1蛋白 原核表達(dá) ELISA捕獲法

【摘要】：柯薩奇病毒(Coxsackievirus,CV)可引起呼吸道感染、HFMD、發(fā)熱性皮疹、皰疹性咽峽炎、及心肌炎、急性弛緩性麻痹和腦炎等疾病，柯薩奇A組16型VP1蛋白（CVA16VP1）是腸道病毒的主要的主要治病病原體。其VP1基因區(qū)編碼的蛋白大多數(shù)都是CVA16病毒的抗原決定簇并決定病毒的抗原性�，F(xiàn)階段對于CVA16的研究還很薄弱，因此，本研究旨在通過基因原核表達(dá)與蛋白純化獲得VP1蛋白，并初步建立CVA16-IgM的酶聯(lián)免疫捕獲法，作為試劑制備和疫苗的評價(jià)方法。 本實(shí)驗(yàn)在安排和設(shè)計(jì)階段做了很多工作：首先，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的含CVA16VP1、VP2和VP3全長序列克隆菌的測序報(bào)告，采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)VP1編碼區(qū)上下游引物，從CVA16培養(yǎng)物當(dāng)中擴(kuò)增VP1蛋白基因序列，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-41a(+)/VP1；其次，進(jìn)行菌落PCR來確定陽性克隆菌落，并雙酶切初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET-41a(+)/VP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-Gold (DE3) pLysS，測序驗(yàn)證正確后誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況，若結(jié)果與預(yù)期一致則進(jìn)行誘導(dǎo)條件優(yōu)化及表達(dá)產(chǎn)物純化，并進(jìn)行Western Blot鑒定免疫反應(yīng)性；最后，，通過辣根過氧化物酶標(biāo)記純化后的重組蛋白VP1，以棋盤滴定法初步確定包被濃度和酶結(jié)合物使用濃度，初步建立ELISA捕獲檢測方法。 在經(jīng)過了上述一系列是的實(shí)驗(yàn)后，我們獲取了一定的成果：首先，成功擴(kuò)增CVA16VP1蛋白基因片段，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-41a(+)/VP1；其次，構(gòu)建了可高效表達(dá)CVA16VP1蛋白的原核表達(dá)菌株，并確定了最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件；SDS-PAGE表明重組蛋白與預(yù)期一致且呈包涵體表達(dá)；經(jīng)親和層析和離子交換層析法純化，獲取了純化后蛋白的濃度，通過Adobe photoshop cs6分析得出重組蛋白的純度；經(jīng)Western Blot檢測證實(shí)重組蛋白VP1能與相應(yīng)抗體發(fā)生反應(yīng)，具有良好的抗原性；最后，確定抗μ抗體最佳包被濃度和酶標(biāo)抗原的最佳稀釋倍數(shù)，初步建立了CVA-IgM的ELISA捕獲檢測方法。該方法特異性、靈敏度較好，有望用于柯薩奇病毒感染的早期診斷。
【關(guān)鍵詞】：柯薩奇病毒A組 16型 VP1蛋白 原核表達(dá) ELISA捕獲法
【學(xué)位授予單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.23
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 主要符號表10-11
• 第一章 緒論11-20
• 1.1 手足口病概述11
• 1.2 手足口病的主要病原體11
• 1.3 CVA16 的基因形態(tài)11-12
• 1.4 CVA16 的流行病學(xué)特征12-14
• 1.4.1 CVA 16 分子流行病學(xué)13-14
• 1.4.2 CVA 16 血清流行病學(xué)14
• 1.5 CVA 16 實(shí)驗(yàn)室診斷和病毒學(xué)監(jiān)測14-16
• 1.5.1 病毒分離法15
• 1.5.2 病毒抗體檢測法15-16
• 1.6 分子生物學(xué)的檢測16-17
• 1.6.1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR( Real-time PCR)16-17
• 1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)17
• 1.6.3 基因芯片技術(shù)( Microarray)17
• 1.7 CA16 的藥物治療及其局限性17
• 1.7.1 抗病毒藥物的研究17
• 1.7.2 免疫球蛋白的研究17
• 1.8 CVA 16 的研究小結(jié)17-18
• 1.9 CVA 16 的預(yù)防18
• 1.10 項(xiàng)目意義18-20
• 第二章 材料與方法20-53
• 2.1 材料20-36
• 2.1.1 受體菌20
• 2.1.2 主要試劑20-21
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要用液的配制21-35
• 2.1.4 主要儀器與設(shè)備35-36
• 2.2 方法36-53
• 2.2.1 CVA 16 VP1 抗原的克隆與鑒定36-43
• 2.2.2 重組抗原蛋白（VP1）的表達(dá)、純化及鑒定43-50
• 2.2.3 捕獲 ELISA 方法的建立50-53
• 第三章 結(jié)果與分析53-60
• 3.1 VP1 基因片段的擴(kuò)增和 pET-41a(+)/VP1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建53-54
• 3.1.1 PCR 擴(kuò)增 VP1 目的基因片段53
• 3.1.2 菌落 PCR 鑒定53-54
• 3.1.3 重組質(zhì)粒 pET-41a(+)/VP1 的雙酶切鑒定54
• 3.1.4 酶切產(chǎn)物的測序鑒定54
• 3.2 重組蛋白 VP1 的原核表達(dá)、純化及鑒定54-58
• 3.2.1 重組蛋白 VP1 的誘導(dǎo)表達(dá)54-55
• 3.2.2 重組蛋白 VP1 的表達(dá)條件的優(yōu)化55-56
• 3.2.3 重組蛋白 VP1 的的純化56-57
• 3.2.4 重組蛋白 VP1 蛋白的 Western Blot 鑒定57
• 3.2.5 蛋白濃度的測定57-58
• 3.3 捕獲法的初步建立58-60
• 3.3.1 陰陽血清篩選58
• 3.3.2 棋盤法確定包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度58
• 3.3.3 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)58
• 3.3.4 精密性試驗(yàn)58-60
• 第四章 討論60-63
• 4.1 VP1 基因的選取60
• 4.2 加入連接臂60-61
• 4.3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化61
• 4.4 重組抗原純化方法的選擇61-62
• 4.5 ELISA 捕獲法檢測方法的建立62-63
• 第五章 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 附錄70-71
• 致謝71-73
• 個(gè)人信息73-74
• 個(gè)人簡歷73-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況74

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周世力,李琳琳,何雅青,楊洪,喻子牛,金奇;我國分離的腸道病毒71型(SHZH03病毒株)全基因組核苷酸序列分析[J];病毒學(xué)報(bào);2004年01期

2 崔愛利,許文波,李秀珠,胡家瑜,凌華,唐偉,楊智宏,張燕,陳立,Hiroyuki Shimizu;腸道病毒71型的RT-PCR診斷及基因特征[J];病毒學(xué)報(bào);2004年02期

3 宋遠(yuǎn)斌;何思杰;余楠;陳欣欣;王斌;車小燕;曾其毅;;柯薩奇病毒A16型VP1-VP4基因克隆及其表達(dá)產(chǎn)物的抗原相關(guān)性分析[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年12期

4 向波;王理;王衛(wèi);李文娟;易梅;李小玲;曾朝陽;李桂源;;抗癌蛋白NOR1基因工程重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化和純化[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年07期

5 武珊;王文瑞;海巖;;柯薩奇病毒A組16型研究進(jìn)展[J];疾病監(jiān)測與控制;2011年08期

6 李忠;張華寧;裴耀文;劉倜;王宇路;劉靜;;不同分子生物學(xué)方法檢測手足口病標(biāo)本的應(yīng)用研究[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床;2009年04期

7 李曉楠;趙忠鵬;段躍強(qiáng);趙曉燕;王希良;李培鋒;;EV71型vP1蛋白表達(dá)、純化及免疫原性的初步評價(jià)[J];免疫學(xué)雜志;2010年03期

8 沙愛龍;劉穎;;手足口病的研究概況[J];生命科學(xué)儀器;2007年11期

9 李永進(jìn);陳媛媛;畢利軍;;融合標(biāo)簽技術(shù)及其應(yīng)用[J];生物工程學(xué)報(bào);2006年04期

10 毛群穎;楊再偉;于翔;荊慶;何鵬;黃維金;吳曉音;萬宗舉;梁爭論;李鳳祥;王軍志;;開封農(nóng)村地區(qū)嬰幼兒中腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型中和抗體水平及流行趨勢[J];中國生物制品學(xué)雜志;2009年09期

本文編號：1133343