本文關鍵詞：柯薩奇病毒A組16型VP1蛋白原核表達、純化及鑒定

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【摘要】：柯薩奇病毒(Coxsackievirus,CV)可引起呼吸道感染、HFMD、發(fā)熱性皮疹、皰疹性咽峽炎、及心肌炎、急性弛緩性麻痹和腦炎等疾病，柯薩奇A組16型VP1蛋白（CVA16VP1）是腸道病毒的主要的主要治病病原體。其VP1基因區(qū)編碼的蛋白大多數(shù)都是CVA16病毒的抗原決定簇并決定病毒的抗原性�，F(xiàn)階段對于CVA16的研究還很薄弱，因此，本研究旨在通過基因原核表達與蛋白純化獲得VP1蛋白，并初步建立CVA16-IgM的酶聯(lián)免疫捕獲法，作為試劑制備和疫苗的評價方法。 本實驗在安排和設計階段做了很多工作：首先，根據(jù)實驗室保存的含CVA16VP1、VP2和VP3全長序列克隆菌的測序報告，采用primer5.0軟件設計VP1編碼區(qū)上下游引物，從CVA16培養(yǎng)物當中擴增VP1蛋白基因序列，構建重組表達質粒pET-41a(+)/VP1；其次，進行菌落PCR來確定陽性克隆菌落，并雙酶切初步鑒定為陽性的重組質粒pET-41a(+)/VP1轉化大腸桿菌BL21-Gold (DE3) pLysS，測序驗證正確后誘導表達，產物經SDS-PAGE分析蛋白表達情況，若結果與預期一致則進行誘導條件優(yōu)化及表達產物純化，并進行Western Blot鑒定免疫反應性；最后，，通過辣根過氧化物酶標記純化后的重組蛋白VP1，以棋盤滴定法初步確定包被濃度和酶結合物使用濃度，初步建立ELISA捕獲檢測方法。 在經過了上述一系列是的實驗后，我們獲取了一定的成果：首先，成功擴增CVA16VP1蛋白基因片段，構建了重組質粒pET-41a(+)/VP1；其次，構建了可高效表達CVA16VP1蛋白的原核表達菌株，并確定了最佳誘導表達條件；SDS-PAGE表明重組蛋白與預期一致且呈包涵體表達；經親和層析和離子交換層析法純化，獲取了純化后蛋白的濃度，通過Adobe photoshop cs6分析得出重組蛋白的純度；經Western Blot檢測證實重組蛋白VP1能與相應抗體發(fā)生反應，具有良好的抗原性；最后，確定抗μ抗體最佳包被濃度和酶標抗原的最佳稀釋倍數(shù)，初步建立了CVA-IgM的ELISA捕獲檢測方法。該方法特異性、靈敏度較好，有望用于柯薩奇病毒感染的早期診斷。
【關鍵詞】：柯薩奇病毒A組 16型 VP1蛋白 原核表達 ELISA捕獲法
【學位授予單位】：河南工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373.23
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 主要符號表10-11
• 第一章 緒論11-20
• 1.1 手足口病概述11
• 1.2 手足口病的主要病原體11
• 1.3 CVA16 的基因形態(tài)11-12
• 1.4 CVA16 的流行病學特征12-14
• 1.4.1 CVA 16 分子流行病學13-14
• 1.4.2 CVA 16 血清流行病學14
• 1.5 CVA 16 實驗室診斷和病毒學監(jiān)測14-16
• 1.5.1 病毒分離法15
• 1.5.2 病毒抗體檢測法15-16
• 1.6 分子生物學的檢測16-17
• 1.6.1 實時熒光定量 PCR( Real-time PCR)16-17
• 1.6.2 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)17
• 1.6.3 基因芯片技術( Microarray)17
• 1.7 CA16 的藥物治療及其局限性17
• 1.7.1 抗病毒藥物的研究17
• 1.7.2 免疫球蛋白的研究17
• 1.8 CVA 16 的研究小結17-18
• 1.9 CVA 16 的預防18
• 1.10 項目意義18-20
• 第二章 材料與方法20-53
• 2.1 材料20-36
• 2.1.1 受體菌20
• 2.1.2 主要試劑20-21
• 2.1.3 實驗主要用液的配制21-35
• 2.1.4 主要儀器與設備35-36
• 2.2 方法36-53
• 2.2.1 CVA 16 VP1 抗原的克隆與鑒定36-43
• 2.2.2 重組抗原蛋白（VP1）的表達、純化及鑒定43-50
• 2.2.3 捕獲 ELISA 方法的建立50-53
• 第三章 結果與分析53-60
• 3.1 VP1 基因片段的擴增和 pET-41a(+)/VP1 重組質粒的構建53-54
• 3.1.1 PCR 擴增 VP1 目的基因片段53
• 3.1.2 菌落 PCR 鑒定53-54
• 3.1.3 重組質粒 pET-41a(+)/VP1 的雙酶切鑒定54
• 3.1.4 酶切產物的測序鑒定54
• 3.2 重組蛋白 VP1 的原核表達、純化及鑒定54-58
• 3.2.1 重組蛋白 VP1 的誘導表達54-55
• 3.2.2 重組蛋白 VP1 的表達條件的優(yōu)化55-56
• 3.2.3 重組蛋白 VP1 的的純化56-57
• 3.2.4 重組蛋白 VP1 蛋白的 Western Blot 鑒定57
• 3.2.5 蛋白濃度的測定57-58
• 3.3 捕獲法的初步建立58-60
• 3.3.1 陰陽血清篩選58
• 3.3.2 棋盤法確定包被濃度和酶結合物工作濃度58
• 3.3.3 交叉反應實驗58
• 3.3.4 精密性試驗58-60
• 第四章 討論60-63
• 4.1 VP1 基因的選取60
• 4.2 加入連接臂60-61
• 4.3 誘導條件的優(yōu)化61
• 4.4 重組抗原純化方法的選擇61-62
• 4.5 ELISA 捕獲法檢測方法的建立62-63
• 第五章 結論63-64
• 參考文獻64-70
• 附錄70-71
• 致謝71-73
• 個人信息73-74
• 個人簡歷73-74
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況74

【參考文獻】

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本文編號：1133343