本文關(guān)鍵詞：金葡菌噬菌體IME-SA1和IME-SA2基因組分析及金葡菌新型檢測(cè)方法研究

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【摘要】：背景和目的 金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）在自然界中無處不在，水、空氣、灰塵及動(dòng)物和人的排泄物中都可找到。金葡菌是人類皮膚表面常見菌群，但它同時(shí)也是一種非常重要的致病菌，是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿性感染，也可引起偽膜性腸炎、肺炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥這類威脅人類生命的疾病。不僅僅是人類，家畜也容易感染金黃色葡萄球菌，金葡菌能夠?qū)е履膛Ｈ橄傺准半u傳染性關(guān)節(jié)炎，這嚴(yán)重威脅了食品安全，導(dǎo)致食品污染，帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。值得注意的是，耐藥金葡菌的感染不斷增加，例如，耐甲氧西林金葡菌（MRSA）和耐萬古霉素金葡菌（VRSA）已引起更多關(guān)注，因?yàn)榻鹌暇轻t(yī)院感染最常見的原因。 噬菌體是自然界中廣泛存在的生物類群，幾乎有細(xì)菌存在的地方就有相應(yīng)噬菌體的存在，例如土壤、海水等。利用噬菌體和噬菌體裂解酶治療細(xì)菌性感染的最新研究，表明噬菌體及其裂解酶是潛在的可代替抗生素用于治療多重耐藥菌感染的新型殺菌物質(zhì)。作為細(xì)菌的天然殺手，噬菌體在治療細(xì)菌性感染尤其是多重耐藥菌感染方面具有抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)勢(shì)：噬菌體能夠在宿主體內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制，因此很小劑量的噬菌體制劑即可達(dá)到治療目的；噬菌體特異性較強(qiáng)，僅能裂解其宿主菌或者同一種屬內(nèi)的細(xì)菌，對(duì)機(jī)體其他正常微生物群落影響很小，且不會(huì)感染人類細(xì)胞，副作用較小；噬菌體不易引起過敏反應(yīng)，可用于對(duì)抗生素過敏的患者；噬菌體能夠單獨(dú)使用也可與其他殺菌物質(zhì)聯(lián)合使用；噬菌體可隨致病菌變異而發(fā)生變異，產(chǎn)生裂解突變細(xì)菌的新的噬菌體。噬菌體裂解酶也有很多優(yōu)勢(shì)：可通過基因工程大量表達(dá)，并能高度純化，底物特異性較強(qiáng)；較噬菌體而言，裂解酶不需要感染和復(fù)制，能更快地發(fā)揮殺菌作用；噬菌體裂解酶具有不同的結(jié)合域和催化域，分別用于細(xì)胞壁的結(jié)合和裂解，因此細(xì)菌不易對(duì)其產(chǎn)生抗性。 本研究中我們對(duì)分離到的兩株金黃色葡萄球菌噬菌體進(jìn)行了基因組學(xué)特征的研究、基因組的同源重組改造，并且建立了金葡菌新型檢測(cè)方法，為金葡菌噬菌體的應(yīng)用和檢測(cè)金葡菌奠定了基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果 利用Ion Torrent測(cè)序方法對(duì)金黃色葡萄球菌噬菌體IME-SA1和IME-SA2進(jìn)行測(cè)序，獲得全部序列信息，拼接基因組并進(jìn)行基因組分析，發(fā)現(xiàn)在其基因組尾端序列中存在大量的重復(fù)序列，而且這些重復(fù)序列是可變的，，從而導(dǎo)致PCR擴(kuò)增出的序列長短不一，并且包含長的序列的噬菌體單克隆在培養(yǎng)繁殖之后PCR可擴(kuò)增出較短序列，在短序列中沒有發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象。同時(shí)，我們結(jié)合兩株噬菌體的基因組特征及其生物學(xué)特性方面的有關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩株噬菌體基因組同源性較高但裂解譜差異較大，因而對(duì)兩株噬菌體進(jìn)行同源重組改造，裂解譜較窄的噬菌體經(jīng)過改造后具有與寬譜噬菌體同樣的裂解譜，這項(xiàng)研究為后續(xù)研究噬菌體的裂解譜形成機(jī)制打下了基礎(chǔ)。 為了建立特異定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌的新型檢測(cè)方法，我們通過NCBI得到能夠特異裂解金葡菌的溶葡球菌酶的基因，對(duì)溶葡球菌酶基因進(jìn)行重新設(shè)計(jì)并進(jìn)行密碼子的優(yōu)化，使其更易在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行可溶性表達(dá)，然后合成目的基因，將其構(gòu)建到表達(dá)載體pQE30，最后成功地在大腸桿菌中表達(dá)了重組溶葡球菌酶lysostaphin，然后利用重組溶葡球菌酶lysostaphin結(jié)合ATP生物發(fā)光技術(shù)建立了特異定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法。結(jié)論 隨著金黃色葡萄球菌耐藥性和致病性日趨嚴(yán)重，積極探索替代抗生素的新型治療方法和建立快速檢測(cè)金葡菌的方法勢(shì)在必行。通過本研究，我們建立了高效的噬菌體同源重組技術(shù)，并且可以使用該技術(shù)對(duì)金葡菌的裂解譜進(jìn)行人工改造，同時(shí)，利用重組溶葡球菌酶結(jié)合ATP發(fā)光法建立了快速、特異、定量檢測(cè)金葡菌的方法，上述研究為金葡菌噬菌體的應(yīng)用和金葡菌的檢測(cè)打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 噬菌體基因組分析 基因組改組 重組溶葡球菌酶 ATP生物發(fā)光法 特異定量檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.11
【目錄】：

• 縮略語表6-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-18
• 第一部分 金黃色葡萄球菌噬菌體 IME-SA1 和 IME-SA2 基因組分析18-33
• 摘要18-19
• 1.材料與方法19-24
• 1.1 材料19
• 1.2 方法19-24
• 2.結(jié)果24-31
• 2.1 序列拼接及基因注釋結(jié)果24-26
• 2.2 噬菌體 IME-SA1 和 IME-SA2 進(jìn)化地位的分析26
• 2.3 噬菌體 IME-SA1 和 IME-SA2 尾端序列分析26-31
• 3.討論31-33
• 第二部分 金黃色葡萄球菌噬菌體 IME-SA1 和 IME-SA2 的重組改造33-45
• 摘要33-35
• 1.材料與方法35-38
• 1.1 材料35
• 1.2 方法35-38
• 2.結(jié)果38-44
• 2.1 金黃色葡萄球菌噬菌體 IME-SA1 和 IME-SA2 裂解譜測(cè)定38
• 2.2 金葡菌噬菌體 IME-SA1 與 IME-SA2 基因組的比較分析38-41
• 2.3 金葡菌噬菌體 IME-SA2 基因組的打斷41-42
• 2.4 通過同源重組獲得以 IME-SA1 為母本、與 IME-SA2 具有相同裂解譜的重組噬菌體42-44
• 3.討論44-45
• 第三部分 基于重組溶葡球菌酶和 ATP 生物發(fā)光技術(shù)快速特異定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌45-60
• 摘要45-46
• 1.材料與方法46-53
• 1.1 材料46-47
• 1.2 方法47-53
• 2.結(jié)果53-58
• 2.1 基因合成和重組質(zhì)粒 pQE30-Lys 轉(zhuǎn)化結(jié)果鑒定53-54
• 2.2 重組溶葡球菌酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化54-55
• 2.3 重組溶葡球菌酶活性檢測(cè)55-56
• 2.4 ATP 測(cè)定法與平板計(jì)數(shù)法56-58
• 2.5 基于 ATP 生物發(fā)光法和重組溶葡球菌酶特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌58
• 3.討論58-60
• 全文結(jié)論60-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 綜述67-80
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 附錄80-84
• 致謝84-85
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄85

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 唐倩倩;葉尊忠;王劍平;蓋鈴;應(yīng)義斌;李雁斌;;ATP生物發(fā)光法在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J];食品科學(xué);2008年06期

2 李利霞;伍金娥;常超;張佳艷;王凌;;ATP生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用可行性分析[J];食品科技;2012年01期

3 郝巧玲,呂斌,周宜開,程光明;生物發(fā)光法快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年01期

4 馬妮;趙虹;張旭;馬景宏;;ATP發(fā)光技術(shù)快速檢測(cè)食品中菌落總數(shù)[J];中國衛(wèi)生工程學(xué);2008年05期

本文編號(hào)：1129819