本文關(guān)鍵詞：雌激素受體S309位點(diǎn)基因替代鼠的建立及該位點(diǎn)磷酸化在小鼠乳腺發(fā)育中的作用

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【摘要】：研究背景： 雌激素及其受體（Estrogen Receptor，ER）信號(hào)系統(tǒng)在乳腺的發(fā)育和功能分化，以及疾病過(guò)程中有著非常重要的作用。乳腺的良惡性病變?nèi)缛橄倌倚栽錾�、乳腺癌等都與ER信號(hào)系統(tǒng)的失調(diào)有關(guān)。自上個(gè)世紀(jì)六十年代Elwood V Jensen首次從理論上證實(shí)雌激素受體的存在以來(lái)，對(duì)于ER的研究一直沒(méi)有間斷過(guò)。雌激素受體有五個(gè)結(jié)構(gòu)域，其激活途徑主要有三種，包括經(jīng)典的配體激活途徑、非經(jīng)典激活途徑及磷酸化激活途徑。ER與雌激素結(jié)合后形成配體-受體復(fù)合物，引發(fā)雌激素受體的構(gòu)象改變形成二聚體并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，并與靶基因上的作用元件ERE結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄；另外ER還可與AP1、SP1等結(jié)合激活相應(yīng)的靶基因轉(zhuǎn)錄。除了配體結(jié)合激活途徑外，ER還有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。這些位點(diǎn)大多位于AF1區(qū)，例如305位絲氨酸的磷酸化可使ER在未與配體結(jié)合狀態(tài)下激活。但目前對(duì)于雌激素受體磷酸化位點(diǎn)與乳腺的發(fā)育、癌變等關(guān)系研究并不透徹。 基因替代鼠（Knockin mice）是研究基因/蛋白特定位點(diǎn)功能的非常有效的途徑和工具，可以建立人類疾病相關(guān)的動(dòng)物模型，在研究探討疾病的發(fā)病機(jī)制、相關(guān)基因分析、疾病預(yù)防等方面起到重要作用；也可以作為新藥研發(fā)的重要評(píng)價(jià)體系。因此，基因替代鼠不僅有利于帶動(dòng)生命科學(xué)的前沿發(fā)展，也在醫(yī)學(xué)研究中起到先導(dǎo)作用。 王瑞安等人前期發(fā)現(xiàn)ER的305位絲氨酸（ER-S305）是一磷酸化位點(diǎn)。Pak1激酶和PKA激酶均可磷酸化這一位點(diǎn)。該位點(diǎn)的磷酸化可使ER在不與配體結(jié)合的狀態(tài)下激活，因而可能參與乳腺的癌變并與乳腺癌對(duì)抗雌激素療法的耐藥性有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)擬建立與人ER-S305位點(diǎn)同位的ER-S309A基因突變鼠，觀察該磷酸化位點(diǎn)的消失對(duì)乳腺發(fā)育和癌變的影響，闡明ER在體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制，并進(jìn)一步探討該位點(diǎn)做為乳腺癌化學(xué)預(yù)防、治療潛在靶點(diǎn)的可能性提供相關(guān)依據(jù)。 目的 通過(guò)建立ER S309A基因替代鼠，研究將該位點(diǎn)的絲氨酸突變?yōu)楸彼崾ミ@一磷酸化位點(diǎn)后小鼠的乳腺發(fā)育情況。通過(guò)觀察純合型替代鼠的乳腺發(fā)育情況、動(dòng)情周期的變化，及給予雌激素后乳腺發(fā)育和動(dòng)情周期的改變，分析ER-S309位點(diǎn)的磷酸化及能夠磷酸化這一位點(diǎn)的激酶分子在生殖功能和乳腺發(fā)育中的作用。 方法 1.建立ER-S309A基因替代鼠。剪尾提取總DNA，PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因改變片段經(jīng)基因測(cè)序確定替代鼠的建立是否成功。 2.將雜合子小鼠相互交配。用PCR結(jié)合酶切分析鑒定基因型。分析子代小鼠的比例是否符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。并觀察純合型雌性小鼠及雄性小鼠是否具有繁育能力，如能繁育則觀測(cè)雌性小鼠的哺育能力。 3.分別測(cè)定純合型與野生型雌性小鼠血中雌二醇的濃度。 4.分別取6、9、12周齡的純合型和野生型雌性小鼠的第3、4對(duì)乳腺卡紅整裝染色觀察發(fā)育情況、HE染色觀察動(dòng)情周期的變化。 5.野生型小鼠三周齡時(shí)行雙側(cè)卵巢去勢(shì)手術(shù)后，分為給予雌激素組和對(duì)照組；純合型突變小鼠三周齡開(kāi)始給予雌激素，分別觀察補(bǔ)充激素組和對(duì)照組小鼠第6、9、12周第4對(duì)乳腺卡紅染色觀察發(fā)育情況，HE染色觀察動(dòng)情周期變化。 6.純合型和野生型雌性替代鼠，取其雙側(cè)卵巢、輸卵管HE染色，，觀察是否有形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果 1.基因測(cè)序結(jié)果顯示309位的絲氨酸被丙氨酸所替代，表明我們成功建立了ER-S309A基因替代鼠。 2.純合型雄性小鼠不具有生育能力。雌性純合型小鼠具有生育能力，但每窩的鼠仔數(shù)量較野生型雌性小鼠的每窩鼠仔數(shù)量有明顯減少，表明生殖力降低。 3.純合型雌性小鼠血中雌二醇濃度同野生型雌性小鼠血中雌二醇濃度相比沒(méi)有明顯差異。 4.純合型雌性小鼠的乳腺發(fā)育較正常野生型小鼠慢，導(dǎo)管生長(zhǎng)緩慢、分支減少，乳腺腺泡數(shù)目減少，終末蕾的數(shù)量和面積減少；純合型小鼠的動(dòng)情周期紊亂，角化細(xì)胞數(shù)量減少。 5.野生型雌性小鼠去勢(shì)后給予雌激素組乳腺可以正常生長(zhǎng)，動(dòng)情周期中出現(xiàn)明顯的角化細(xì)胞；未給予雌激素的對(duì)照組乳腺卡紅染色沒(méi)有明顯的導(dǎo)管生成，沒(méi)有動(dòng)情周期出現(xiàn)。純合型雌性小鼠三周開(kāi)始給予雌激素后導(dǎo)管生長(zhǎng)速度加快、分支多，終末蕾的數(shù)量、面積增多；動(dòng)情周期可見(jiàn)多量角化細(xì)胞。 6.純合型雌性小鼠卵巢和輸卵管沒(méi)有明顯的形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)論 1.ERS309A基因替代鼠的建立成功； 2.失去ERS309A磷酸化位點(diǎn)后，雌激素受體功能降低，雄性小鼠喪失生殖功能；雌性小鼠生殖能力降低。 3.純合替代鼠血中雌二醇含量正常。 4.動(dòng)情周期中S309A替代鼠由于ER功能下降，陰道上皮角化細(xì)胞數(shù)量減少，給予雌激素后角化恢復(fù)； 5.乳腺發(fā)育中S309A替代鼠乳腺導(dǎo)管由于ER功能下降，生長(zhǎng)速度減慢、發(fā)育受阻。在高水平雌激素作用下，導(dǎo)管的發(fā)育缺陷可被糾正。
【關(guān)鍵詞】：雌激素受體 雌激素 乳腺 基因替代鼠
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-25
• 1. 雌激素受體15-18
• 2. 雌激素受體的激活途徑18-20
• 3. 雌激素受體在機(jī)體發(fā)育中的作用20-21
• 4. 雌激素受體在腫瘤中的作用21-22
• 5. 人體正常乳腺發(fā)育與乳腺癌22-23
• 6. 小鼠乳腺發(fā)育23-24
• 7. 基因替代鼠24-25
• 第一部分 ER S309A 基因替代鼠的建立25-41
• 引言25-26
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料26-28
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 1.2 主要試劑和儀器26-28
• 2. 方法28-35
• 2.1 S309 基因替代鼠的構(gòu)建28-29
• 2.2 純合型小鼠基因測(cè)序29-32
• 2.3 S309 基因替代鼠基因型鑒定32-35
• 3. 結(jié)果35-40
• 4. 討論40-41
• 第二部分 ER S309A 基因替代鼠的表型分析41-81
• 引言41-42
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料42-45
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42-43
• 1.2 組織標(biāo)本43
• 1.3 所用儀器和試劑43-45
• 2. 方法45-52
• 2.1 S309 基因替代鼠基因型鑒定45-48
• 2.2 ER S309 基因替代鼠繁育能力48
• 2.3 ER S309 基因替代鼠生殖口與陰道之間距離48
• 2.4 血清中雌二醇含量測(cè)定48-49
• 2.5 S309 基因替代鼠乳腺發(fā)育情況49
• 2.6 S309 基因替代鼠表型分析:49-51
• 2.7 基因替代鼠卵巢、輸卵管 HE 染色51-52
• 3. 結(jié)果52-79
• 4. 討論79-81
• 小結(jié)81-82
• 參考文獻(xiàn)82-88
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果88-89
• 致謝89

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