本文關鍵詞：大腸桿菌LTB聯合EV71亞單位疫苗VP1鼻腔免疫效果評價

  更多相關文章： LTB EV71 粘膜免疫

【摘要】：手足口病是由腸道病毒感染引起的，可以產生多種并發(fā)癥，嚴重者可致死。引發(fā)手足口病的腸道病毒以柯薩奇病毒A16型（coxsackievirus A16，Cox A16）和腸道病毒71型（enterovirus71，EV71）最為常見，VP1作為EV71的毒力蛋白具有極其重要的研究價值。VP1蛋白構象發(fā)生變化導致病毒釋放RNA到宿主細胞，同時VP1蛋白也是病毒主要的表達抗原及中和表位。因此，VP1結構蛋白成為了發(fā)展腸道病毒71型亞單位疫苗的候選抗原。 耐熱腸毒素（heat-stable enterotoxin，ST）和不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin，， LT)是產腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)分泌的兩種毒性蛋白。LT的B亞單位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTB)已被研究證實是有效的粘膜免疫佐劑，與其它抗原聯合進行粘膜免疫后可刺激機體產生強烈的系統(tǒng)免疫應答和粘膜免疫應答。 目的：構建重組產腸毒素大腸桿菌LTB基因的原核表達載體pET32a-LTB，檢測誘導表達的6×His-LTB融合蛋白的免疫原性，并探討EV71型VP1蛋白聯合純化LTB通過鼻腔粘膜免疫的效果。 方法：（1）構建重組質粒pET32a-LTB，轉化Escherichia coliBL21(DE3), IPTG誘導表達。（2）表達的LTB融合蛋白帶有6個His標簽，可通過His標簽瓊脂鎳柱純化，純化蛋白復性濃縮后經新西蘭大白兔頸背部和后腳掌多點注射進行皮下免疫，抗原每次免疫的劑量為300μg，一共免疫3次，免疫間隔時間為2周，末次免疫7d后，用注射器從兔心臟直接取血，血液自然凝固后離心分離血清，采用間接ELISA法檢測抗血清中IgG抗體效價。（3）分別用生理鹽水、EV71VP1、LTB聯合EV71VP1經鼻腔免疫BALB/c小鼠，一共免疫三次，免疫間隔時間為一周，第三次免疫10d后收集小鼠心臟血清、肺部沖洗液、小腸粘膜沖洗液，用間接ELISA法檢測血清中抗原特異性IgG和粘膜沖洗液中抗原特異性IgA。 結果：（1）經過質粒雙酶切鑒定、半定量PCR、質粒測序證實已成功構建重組原核表達質粒pET32a-LTB。（2）6×His-LTB融合蛋白在BL21(DE3)中的主要存在形式為包涵體，表達的目的蛋白相對分子質量（Mr）約為30kD；300ml菌液純化的LTB蛋白復性濃縮至3ml后濃度為2.12mg／ml，ELISA檢測其免疫兔所得抗血清IgG效價為1∶125000。（3）EV71VP1聯合LTB免疫組的血清特異性IgG，肺部沖洗液和小腸粘膜沖洗液中特異性IgA抗體水平相較于EV71VP1單獨免疫組和生理鹽水對照組有明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學意義。 結論：已成功在E. coli BL21(DE3)中表達了6×His-LTB融合蛋白，純化的融合蛋白具有良好的免疫原性和佐劑活性。通過滴鼻免疫，LTB可有效誘導和增強EV71VP1的粘膜免疫應答，提高特異性血清抗體效價，為研制高效安全的EV71口服疫苗奠定了基礎。
【關鍵詞】：LTB EV71 粘膜免疫
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英漢縮略詞對照5-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-17
• 第一部分 LTB 的表達、純化與免疫原性分析17-31
• 1 實驗材料17-20
• 2 實驗方法20-24
• 3 實驗結果24-28
• 4 討論與小結28-31
• 第二部分 EV71 VP1 聯合 LTB 的鼻腔免疫評價31-39
• 1 實驗材料31-32
• 2 實驗方法32-34
• 3 實驗結果34-37
• 4 討論與小結37-39
• 全文小結39
• 本課題進一步試驗計劃39-40
• 參考文獻40-43
• 文獻綜述 鼻腔粘膜免疫及其佐劑研究進展43-52
• 參考文獻49-52
• 致謝52-53
• 攻讀碩士學位期間的論文53-54

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 靳妍;張靜;孫軍玲;常昭瑞;;2011年中國大陸手足口病流行特征分析[J];疾病監(jiān)測;2012年09期

2 姜柯安;賀志良;宋方洲;馬永平;;產腸毒素大腸桿菌K88菌毛蛋白與大腸桿菌不耐熱腸毒素b亞單位的原核表達及其鼻腔免疫效果[J];中國生物制品學雜志;2012年09期

3 賀志良;姜柯安;宋方洲;馬永平;;產腸毒素大腸桿菌987P菌毛蛋白FasA亞單位的原核表達及其免疫原性[J];中國生物制品學雜志;2012年09期

4 周建嫦,張建中,何利華,徐采樸,張茂俊,盛濤,郭浩巖,肖文平;幽門螺桿菌cagA克隆表達[J];微生物學免疫學進展;2002年04期

5 鄭繼平;腸毒素大腸桿菌疫苗研究進展[J];微生物學免疫學進展;2003年01期

6 李國平,楊恬;粘膜免疫系統(tǒng)的研究進展[J];細胞與分子免疫學雜志;2001年06期

7 王冠;沈敘莊;;粘膜相關淋巴組織的結構特征及粘膜疫苗的研究進展[J];中國計劃免疫;2007年01期

8 李江;馬永平;李世彬;賀志良;姜柯安;;重疊延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表達[J];中國微生態(tài)學雜志;2011年05期

9 徐輝,高杰英,舒翠莉,彭虹,石辛甫,邢麗,陳志華;雙價痢疾工程疫苗經粘膜免疫動物的實驗研究[J];中華微生物學和免疫學雜志;2001年05期

10 王志明;孟雅娟;賀丞;高健;;黏膜疫苗的研究現狀與進展[J];中國藥學雜志;2014年01期

本文編號：1110069