發(fā)布時間：2017-10-28 17:16

  本文關(guān)鍵詞：人肝臟特異性miR-122重組慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

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【摘要】：目的構(gòu)建microRNA-122(miR-122)的重組過表達(dá)慢病毒,并對其進(jìn)行病毒包裝、鑒定與滴度測定,為進(jìn)一步研究miR-122的功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法利用PCR法擴(kuò)增人類基因組DNA中miR-122發(fā)夾前體結(jié)構(gòu)RNA,并將其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表達(dá)載體上,經(jīng)酶切及基因測序鑒定,將陽性重組PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro表達(dá)載體、p CMV-VSV-G和p CMVdR8.91三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞,收獲上清液,將所得病毒懸液濃縮后梯度稀釋后感染HEK-293T細(xì)胞,并利用綠色熒光蛋白進(jìn)行病毒滴度測定。將重組慢病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞,并利用實(shí)時定量PCR檢測miR-122的表達(dá)。結(jié)果重組慢病毒表達(dá)載體PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro酶切及測序鑒定證明載體構(gòu)建成功,并得到滴度為3×108TU/m L的病毒液。病毒感染人皮膚成纖維細(xì)胞后miR-122表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論通過優(yōu)化miRNA載體構(gòu)建方法成功構(gòu)建人miR-122的重組慢病毒載體并可在人類成纖維細(xì)胞內(nèi)顯著過表達(dá)miR-122,為miR-122的研究提供更高效穩(wěn)定的基因載體。
【作者單位】： 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院小兒外科;中山大學(xué);
【關(guān)鍵詞】： miR- 慢病毒 載體構(gòu)建
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號:30872700)
【分類號】：R373
【正文快照】： microRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物的長度為21~25 nt的非蛋白質(zhì)編碼小RNA。它們不具有開放閱讀框架,不編碼蛋白質(zhì),以其序列特異性的方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),參與多種重要的生命活動包括細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等,從而受到廣泛關(guān)注[1-3]。miRNA能夠和互補(bǔ)或部分互

【共引文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：1109192