發(fā)布時間：2017-10-28 09:27

  本文關(guān)鍵詞：下調(diào)CD151對臍帶間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性影響的初步研究

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【摘要】：背景：間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是多能成體干細胞的一種，起源于中胚層、可高度自我更新、且有多向分化潛能，廣泛存在于全身組織如骨髓、臍血、臍帶、絨毛膜、胎盤等，能在體外培養(yǎng)擴增，并能在體外特定誘導(dǎo)條件下分化成為骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞等，MSCs獨特的生物學(xué)特性是其具有廣闊實驗研究和臨床應(yīng)用的前提條件。4跨膜蛋白家族(TetraspaninSuper Family，TM4SF)是小分子糖蛋白中一員，4次跨細胞膜。不同種類的4跨膜蛋白或與其它跨膜蛋白在4跨膜蛋白密集微區(qū)(tetraspanin-enrichedmicrodomains，TEM)可以相互耦聯(lián)成復(fù)合體，正是這個復(fù)合體結(jié)構(gòu)使其具有重要生物學(xué)功能。CD151是四跨膜蛋白家族的重要成員之一，首次在血小板內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)，在細胞粘附，遷移，增殖，活化，腫瘤細胞生長，轉(zhuǎn)移和成血管中起到關(guān)鍵作用。 目的：本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord-derived MSCs，UC-MSCs)幾乎100%表達CD151，但到目前為止CD151對于UC-MSCs的生物學(xué)特性有何影響，尚無深入的報道，本實驗就基于此實驗結(jié)果開展。siRNA(smallinterference RNA)干擾UC-MSCs表面CD151，使UC-MSCs CD151表達下降。比較干擾后UC-MSCs生物學(xué)特性變化（如干細胞表面標(biāo)記、誘導(dǎo)成脂、成骨分化能力），并初步檢測其對UC-MSCs免疫調(diào)節(jié)、造血支持的影響。 方法：（1）采用膠原酶消化法分離出臍帶組織的原代細胞，貼壁培養(yǎng)純化方法傳代細胞。流式細胞儀檢測相關(guān)干細胞表面標(biāo)記，，體外成脂、成骨誘導(dǎo)分化。（2）siRNA干擾UC-MSCs表面CD151，實驗分為3組，實驗組（siRNA-CD151group）：siRNA干擾UC-MSCs CD151;陰性對照組（siRNA-NC group）：siRNA干擾UC-MSCs非特異序列;空白對照組（Blank group）：不使用siRNA干擾UC-MSCs。24h、48h、72h后流式細胞儀分別檢測干擾效率，篩選最佳干擾時間后實時定量PCR檢測CD151mRNA表達情況；成脂、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基比較3組細胞分化潛能；檢測相關(guān)干細胞表型變化。（3）植物血凝素（PHA）刺激人外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)后分別與3組細胞建立共培養(yǎng)體系，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測上清中γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)水平；Real-time PCR檢測3組細胞免疫調(diào)節(jié)因子如HGF、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX-2)、人吲哚胺2，3-過氧化酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO)mRNA水平。（4）免疫磁珠(MACS)分選臍血CD34+細胞，流式細胞儀檢測分選效率，收集上述各組細胞條件培養(yǎng)基與CD34+細胞共培養(yǎng)，于第7d、14d、21d分別觀察造血集落形態(tài)及統(tǒng)計造血集落總數(shù)。 結(jié)果： 1.分離臍帶組織，培養(yǎng)UC-MSCs 酶消化所得的原代細胞符合干細胞形態(tài)特征，表達干細胞表面標(biāo)記，可誘導(dǎo)分化為脂肪細胞、成骨細胞； 2.siRNA干擾UC-MSCs細胞表面CD-151 （1）siRNA干擾72h為最佳干擾時間，實驗組細胞膜表面CD151表達水平（11.97±2.63%）與對照組（95.66±1.56%）、空白組（95.48±4.04%）相比明顯下降（P0.05，P0.05），實驗組CD151mRNA表達水平與對照組、空白組相比下調(diào)均為7.7倍，差異明顯降低（P0.01，P0.01）； （2）3組細胞貼壁生長，均為典型的成纖維細胞形態(tài)；流式細胞儀均可檢測到3組細胞表面CD73、CD90、CD105和HLA-ABC；未檢測到CD34、CD45：其中實驗組CD105表達水平（83.37±0.71%）與對照組（93.66±0.21%）、空白組（91.87±0.75%）相比顯著下降（P0.05，P0.05）； （3）在不同分化培養(yǎng)基狀態(tài)下，盡管3組細胞均可向成骨、脂肪細胞分化：但是實驗組脂滴與對照組、空白組相比無明顯差異；而實驗組中鈣鹽沉積體積減小，數(shù)量增加； 3.干擾CD-151后，對UC-MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響 （1）PBMC，PHA與干擾后UC-MSCs細胞共培養(yǎng)，實驗組上清中IFN-γ水平與對照組、空白組相比顯著上升（P0.05，P0.05）。 （2）實驗組中HGF、TGFβ-1的mRNA表達量相比于對照組和空白組，均明顯降低（P0.01，P0.01）、COX-2mRNA升高（P0.05）、IDO無差異；ELISA檢測實驗組HGF分泌量亦同樣下降（P0.01）； 4.干擾CD-151后，對UC-MSCs造血支持作用的影響 實驗組和對照組細胞條件培養(yǎng)基均能形成造血集落，包括粒系集落形成單位(Colony forming unit-granulocyte，CFU-G)、粒-巨噬集落形成單位(Colony formingunit-granulocyte and macrophage，CFU-GM)、巨噬系集落形成單位(Colony formingunit-macrophage，CFU-M)，未觀察到紅細胞系集落形成單位（Colony formingunit-erythroid, CFU-E），集落體積較小，散在分布，數(shù)量較少，出現(xiàn)時間較晚，各組細胞間集落總數(shù)無差異；上述各種集落形成單位在陽性培養(yǎng)基中均可見；siRNA干擾UC-MSCs72h的條件培養(yǎng)基仍然具有促使CD34+細胞分化的作用，具備造血支持能力，CD34+細胞朝髓細胞系分化而不朝紅細胞分化。 結(jié)論： 1.siRNA-CD151作用72h后可成功下調(diào)UC-MSC CD151mRNA表達，干擾CD151后UC-MSC仍保持干細胞表面標(biāo)記，體外誘導(dǎo)成脂肪分化無明顯變化，但可影響其成骨誘導(dǎo)分化能力； 2.siRNA-CD151能降低UC-MSC抑制PBMC分泌γ-干擾素的能力，其機制可能是通過相關(guān)可溶性免疫調(diào)節(jié)因子的表達改變從而影響其免疫調(diào)節(jié)作用； 3.siRNA干擾后細胞條件培養(yǎng)基仍然具有促使CD34+細胞分化的作用，具備造血支持能力，但2組細胞間集落總數(shù)無差異，表明CD151可能不是UC-MSC發(fā)揮造血支持作用的主要分子。
【關(guān)鍵詞】：CD151 小干擾RNA 臍帶間充質(zhì)干細胞 生物學(xué)特性 免疫調(diào)節(jié) 造血支持
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-10
• 目錄10-11
• 第一部分 前言11-19
• 1.1 干細胞簡述11-15
• 1.1.1 MSCs 的多向分化潛能11-12
• 1.1.2 MSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用12-14
• 1.1.3 MSCs 的造血支持作用14-15
• 1.1.4 UC-MSCs 的特點15
• 1.2 CD151 概述15-18
• 1.2.1 CD151 的結(jié)構(gòu)特點16
• 1.2.2 CD151 的組織分布16
• 1.2.3 CD151 與整合素16-17
• 1.2.4 CD151 的功能17-18
• 1.3 本研究的內(nèi)容及意義18-19
• 第二部分 實驗技術(shù)路線19-21
• 2.1 人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定19
• 2.2 RNAi MSCs 表面 CD151 及檢測干擾效率19-20
• 2.3 干擾 CD151 MSCs 對免疫調(diào)節(jié)的影響20
• 2.4 干擾 CD151 MSCs 對造血支持的影響20-21
• 第三部分 材料、試劑與儀器21-24
• 3.1 材料21
• 3.2 主要試劑21-22
• 3.3 主要儀器22-23
• 3.4 主要溶液配制23-24
• 第四部分 實驗方法24-33
• 第五部分 實驗結(jié)果33-45
• 5.1 UC-MSC 的生物學(xué)特性33-34
• 5.2 siRNA 干擾 UC-MSC34-39
• 5.3 干擾后對免疫調(diào)節(jié)影響39-42
• 5.4 干擾后對造血支持的影響42-44
• 實驗結(jié)果小結(jié)44-45
• 第六部分 討論、存在的問題及不足45-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-56
• 附錄一 主要溶液配置56-57
• 附錄二 英文縮略圖表57-59
• 附錄三 在校期間發(fā)表論文情況59
• 附錄四 在校期間參加的學(xué)術(shù)會議59-60
• 致謝60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 房佰俊,韓欽,楊少光,趙春華;TGF-β1對成人骨髓CD105~+間充質(zhì)干細胞增殖與分化的影響[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年03期

2 王小娜;李正;王tR;蘭愛平;吳文;;TGF-β_1在雷奈酸鍶促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化中的作用[J];中國病理生理雜志;2011年12期

3 李麗娜;韓之波;王有為;羅偉峰;及月茹;楊舟鑫;馮莉;戚仁斌;李揚秋;韓忠朝;;人臍帶間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基體外支持造血的功能[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2012年04期

本文編號：1107674