發(fā)布時(shí)間：2017-10-26 22:20

  本文關(guān)鍵詞：中國(guó)登革Ⅲ型和Ⅳ型病毒分離株及登革Ⅳ型病毒減毒株特性研究

  更多相關(guān)文章： 登革4型病毒 毒力 序列分析 基因型 登革4型病毒 減毒株 毒力 免疫原性 空斑純化 毒力位點(diǎn) 登革3型病毒 二級(jí)結(jié)構(gòu) 亞型 進(jìn)化樹

【摘要】：Ban18株于1981年分離于我國(guó)西雙版納地區(qū)，將Ban18株和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株H241株分別在Vero細(xì)胞和乳鼠腦內(nèi)傳代，用空斑法在Vero細(xì)胞單層上進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，結(jié)果表明兩株病毒均對(duì)Vero細(xì)胞有致細(xì)胞病變作用，可以形成肉眼可見的空斑，病毒滴度分別為2.0×105PFU/mL和5.1×107PFU/mL。根據(jù)GenBank上已經(jīng)提交的其它登革4型病毒全基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增Ban18株和H241株全基因組的引物，測(cè)定兩株病毒的基因組序列，并進(jìn)行比對(duì)。測(cè)序結(jié)果表明，兩株病毒全長(zhǎng)均為10664nt，含一個(gè)開放閱讀框，，編碼3387個(gè)氨基酸，兩株病毒核苷酸同源性和氨基酸同源性分別為99.7%和99.4%，全基因組中共有6個(gè)核苷酸差異位點(diǎn)和3個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)。采用E基因區(qū)段序列對(duì)兩株病毒進(jìn)行基因分型，兩株病毒均為基因Ⅰ型。 將登革4型病毒Ban18株及其在原代地鼠腎細(xì)胞上傳代的減毒株（Ban18HK20和Ban18HK30株）在Vero細(xì)胞傳代后進(jìn)行生物學(xué)特征和基因序列特征的研究。結(jié)果表明，三株病毒均能被登革4型特異性腹水有效中和，中和指數(shù)1000，提示三株病毒均為登革4型病毒。Ban18HK20株和Ban18HK30株在Vero細(xì)胞上形成的空斑形態(tài)較其母株大且模糊。二者對(duì)9~11g小鼠的腦內(nèi)lg(PFU/LD50）均4.5，而Ban18株的lg(PFU/LD50)為0.4，且二者對(duì)2~4日齡乳鼠的致病力也明顯低于其母株Ban18株，說明表明Ban18株在傳代過程中毒力逐漸減弱。將三株病毒稀釋到106PFU/mL后免疫小鼠，兩周后用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株H241株進(jìn)行腦內(nèi)攻擊，結(jié)果表明Ban18株和Ban18HK20株對(duì)H241腦內(nèi)攻擊的保護(hù)指數(shù)約為100，而Ban18HK30株對(duì)H241的腦內(nèi)攻擊基本沒有保護(hù)作用，說明前二者的免疫原性較好。同時(shí)，為了獲得毒力更低的毒株，本實(shí)驗(yàn)將兩株減毒株Ban18HK20株和Ban18HK30株進(jìn)行空斑純化，分別挑選9個(gè)和5個(gè)空斑克隆進(jìn)行空斑形態(tài)和5~6日齡乳鼠腦內(nèi)毒力的比較，結(jié)果表明從Ban18HK20株挑選的9個(gè)克隆株中的3個(gè)毒株對(duì)乳鼠腦內(nèi)毒力低于Ban18HK20原株，Ban18HK30株的5個(gè)克隆株則無明顯差別。 比較Ban18株及其減毒株的全基因組序列，結(jié)果表明Ban18株和Ban18HK20株有8處核苷酸差異，其中3處引起氨基酸變化，即C111位、E155位、E369位和3’UTR219位，這幾位變化可能與病毒毒力密切相關(guān)，特別是E155和3’UTR216，E155位會(huì)影響E蛋白的糖基化，3’UTR216位會(huì)改變3’UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 桂登-1株（GD-1株）和桂登-11株（GD-11株）分離自1980年廣西合浦縣的登革熱流行中，均為登革3型病毒。本研究將兩株病毒在NIH乳鼠腦內(nèi)傳代兩次后，病毒滴度達(dá)到3×103PFU/mL，同時(shí)將國(guó)際登革3型標(biāo)準(zhǔn)株標(biāo)準(zhǔn)株H87在乳鼠腦內(nèi)傳代一次，病毒滴度為2.6×105PFU/mL。前二者在Vero細(xì)胞單層上形成的空斑形態(tài)與H87株有明顯差異。測(cè)定上述三株病毒的全基因組序列并進(jìn)行分析，兩株病毒全長(zhǎng)均為10707nt，與H87株核苷酸同源性為96.0%，氨基酸同源性為98.8%。GD-1株和GD-11株間僅有4個(gè)氨基酸差異，二者和H87株分別存在39和41個(gè)氨基酸差異。對(duì)3’UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，二者與H87株存在較大差異。根據(jù)E蛋白基因序列對(duì)兩株病毒進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果表明二者均屬于亞型Ⅱ，與分離自泰國(guó)的兩株毒株進(jìn)化關(guān)系最近。
【關(guān)鍵詞】：登革4型病毒 毒力 序列分析 基因型 登革4型病毒 減毒株 毒力 免疫原性 空斑純化 毒力位點(diǎn) 登革3型病毒 二級(jí)結(jié)構(gòu) 亞型 進(jìn)化樹
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 第一部分 我國(guó)云南分離株（Ban18）與國(guó)際登革 4 型標(biāo)準(zhǔn)株（H241 株）的生物學(xué)特性和全基因組序列比較研究5-33
• 中文摘要5-6
• 英文摘要6-7
• 前言7-9
• 材料和方法9-18
• 1 實(shí)驗(yàn)材料9-11
• 2 實(shí)驗(yàn)方法11-18
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果18-31
• 1 Ban18 株和 H241 株的生物學(xué)特征比較18-19
• 1.1 病毒滴度18
• 1.2 兩株病毒特異性鑒定18-19
• 1.3 兩株病毒腦內(nèi)致病力比較19
• 2 Ban18 株和 H241 株全基因序列分析19-31
• 2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果19-20
• 2.2 H241 株和 Ban18 株的全序列比較20-27
• 2.3 Ban18 株與國(guó)內(nèi)外其它登革 4 型病毒的序列比較27-28
• 2.4 Ban18 株系統(tǒng)進(jìn)化分析28-31
• 討論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-33
• 第二部分 云南登革 4 型版 18 株病毒減毒株的生物學(xué)特性和基因全序列研究33-61
• 中文摘要33-34
• 英文摘要34-35
• 前言35-38
• 材料和方法38-44
• 1 實(shí)驗(yàn)材料38-40
• 2 實(shí)驗(yàn)方法40-44
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-55
• 1 生物學(xué)特性44-52
• 1.1 Ban18 減毒株與其母株在 Vero 細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線44-45
• 1.2 Ban18 減毒株與其母株在 Vero 細(xì)胞上空斑形成特征45
• 1.3 登革 4 型特異性血清對(duì)三株病毒的中和抑制作用45-46
• 1.4 三株病毒對(duì)小鼠的腦內(nèi)致病力46-47
• 1.5 三株病毒的免疫原性比較47-48
• 1.6 Ban HK20 株和 Ban18 HK30 株各空斑克隆的生物學(xué)特征48-52
• 2 Ban18 減毒株與其母株的全基因序列比較52-55
• 2.1 兩株病毒 PCR 擴(kuò)增結(jié)果52-53
• 2.2 Ban18 減毒株與其母株的全基因序列比較53-55
• 討論55-59
• 1 生物學(xué)特征研究55-57
• 2 基因序列特征分析57-59
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 第三部分 中國(guó)廣西登革 3 型病毒分離株與國(guó)際 DEN-3 標(biāo)準(zhǔn)株的生物學(xué)和基因特征研究61-79
• 中文摘要61-62
• 英文摘要62-63
• 前言63-65
• 材料和方法65-68
• 1 實(shí)驗(yàn)材料65
• 2 實(shí)驗(yàn)方法65-68
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68-76
• 1 病毒滴度和空斑形態(tài)68
• 2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果68-69
• 3 GD-1 株和 GD-11 株序列特征分析69-76
• 3.1 GD-1 株和 GD-11 株基因組結(jié)構(gòu)特征69-70
• 3.2 兩株病毒與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株 H87 株同源性分析70-71
• 3.3 兩株病毒與 H87 株的差異位點(diǎn)71-73
• 3.4 兩株病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析73-76
• 討論76-77
• 參考文獻(xiàn)77-79
• 登革病毒減毒疫苗研究進(jìn)展79-89
• 1 傳統(tǒng)減毒疫苗79-81
• 2 新型減毒疫苗81-84
• 3 總結(jié)84-85
• 參考文獻(xiàn)85-89
• 致謝89-90

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本文編號(hào)：1100720