本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用大塊平鋪法對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、傳代、凍存及復(fù)蘇的研究

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【摘要】：目的：應(yīng)用四種不同的培養(yǎng)方法進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、傳代、凍存、復(fù)蘇，比較各方法之間優(yōu)劣,探索并建立一種簡(jiǎn)單、實(shí)用的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為再生醫(yī)學(xué)以及實(shí)驗(yàn)研究提供新的培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。 方法：分別以1大塊平鋪法；2傳統(tǒng)組織塊法；3膠原酶Ⅳ消化法；4.膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法，四種不同的方法對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分離、培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄各組細(xì)胞首次融合時(shí)間、各組成功率，并以臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活性，以第3代細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞免疫表型。 結(jié)果：1細(xì)胞形態(tài)：鏡下可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，無(wú)序生長(zhǎng)，可呈渦旋狀生長(zhǎng)。2免疫表型鑒定：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行免疫表型鑒定。結(jié)果顯示：CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽(yáng)性表達(dá)，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達(dá)。3統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析(由于膠原酶Ⅳ消化法無(wú)一例成功，則不做分析)。3.1首次融合時(shí)間：大塊平鋪法(17.81±0.85d)明顯早于傳統(tǒng)組織塊法(24.89±0.97d)，差異有顯著性（P＜0.05），但明顯晚于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法(7.35±0.61d)，，差異有顯著性（P＜0.05）。3.2穩(wěn)定傳代：大塊平鋪法(11.08±0.74代)與傳統(tǒng)組織塊法(11.04±0.77代)無(wú)明顯差別，差異無(wú)顯著性（P＞0.05），但明顯長(zhǎng)于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法(6.82±0.64代)，差異有顯著性（P＜0.05）。3.3細(xì)胞活性：大塊平鋪法(90.84±0.83%)與傳統(tǒng)組織塊法(90.67±0.88%)無(wú)明顯差別，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法(75.06±0.90%)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3.4成功率：大塊平鋪法與傳統(tǒng)組織塊法差異無(wú)顯著性（P＞0.0167），但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法，差異有顯著性（P＜0.0167）。 結(jié)論：1臍帶華通膠組織是人間充質(zhì)干細(xì)胞的重要來(lái)源。2應(yīng)用大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法三種方法可成功培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，而應(yīng)用膠原酶Ⅳ消化法則很難成功培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，原因在于華通膠組織中含有大量的透明質(zhì)酸，單用膠原酶Ⅳ很難消化完全，需添加透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化方可行。3鏡下可見(jiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，可呈無(wú)序生長(zhǎng)，呈渦旋狀生長(zhǎng)。4大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞均可穩(wěn)定傳代、凍存、復(fù)蘇，復(fù)蘇后細(xì)胞增殖穩(wěn)定。5大塊平鋪法實(shí)驗(yàn)操作上省去了剪碎以及鋪塊等最為繁瑣的過(guò)程，比傳統(tǒng)組織塊法更為簡(jiǎn)便，而以往研究表明，酶消化法操作繁瑣，不如傳統(tǒng)組織塊法簡(jiǎn)單。膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法是酶消化法的一種，同樣操作繁瑣，大塊平鋪法操作明顯較膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法簡(jiǎn)單，且原代培養(yǎng)獲得MSCs的時(shí)間要短于傳統(tǒng)組織塊法，提高了獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的效率；以往研究表明，傳統(tǒng)組織塊法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞活性要優(yōu)于酶消化法，而大塊平鋪法細(xì)胞活性與傳統(tǒng)組織塊法無(wú)差別，明顯優(yōu)于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法；大塊平鋪法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成功率與傳統(tǒng)組織塊法無(wú)差別，且明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法。6應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型表明：CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽(yáng)性表達(dá)，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達(dá)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型。 因此大塊平鋪法是一種簡(jiǎn)單、實(shí)用的原代培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,本研究為再生醫(yī)學(xué)以及實(shí)驗(yàn)研究提供了一種新的培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 培養(yǎng) 大塊平鋪法 簡(jiǎn)單實(shí)用 流式細(xì)胞術(shù)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 前言9-10
• 材料與方法10-15
• 結(jié)果15-17
• 附圖17-23
• 附表23-24
• 討論24-27
• 結(jié)論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-32
• 綜述 人間充質(zhì)干細(xì)胞的特性、臨床應(yīng)用及前景32-42
• 參考文獻(xiàn)37-42
• 致謝42-43
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷43

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 湯天軍;楊波;楊漢東;張有順;胡禮儀;李東鋒;張繼紅;;人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2005年21期

2 徐燕;李長(zhǎng)虹;孟恒星;郝牧;邱錄貴;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其生物學(xué)特性[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年32期

3 何培根,余正堂;體外用條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2002年04期

4 侯玲玲,曹華,魏國(guó)榮,白慈賢,張涌,吳祖澤,裴雪濤;人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究[J];中華血液學(xué)雜志;2002年08期

5 陳宇;張寧坤;楊明;沈燕華;王麗華;高連如;;臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2010年16期

本文編號(hào)：1093076