本文關鍵詞：應用大塊平鋪法對人臍帶間充質干細胞分離、傳代、凍存及復蘇的研究

  更多相關文章： 人臍帶間充質干細胞 培養(yǎng) 大塊平鋪法 簡單實用 流式細胞術

【摘要】：目的：應用四種不同的培養(yǎng)方法進行人臍帶間充質干細胞的分離、傳代、凍存、復蘇，比較各方法之間優(yōu)劣,探索并建立一種簡單、實用的人臍帶間充質干細胞的培養(yǎng)方法，為再生醫(yī)學以及實驗研究提供新的培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞的方法。 方法：分別以1大塊平鋪法；2傳統(tǒng)組織塊法；3膠原酶Ⅳ消化法；4.膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法，四種不同的方法對臍帶間充質干細胞進行細胞分離、培養(yǎng)、傳代、凍存、復蘇。鏡下觀察細胞形態(tài)，記錄各組細胞首次融合時間、各組成功率，并以臺盼藍染色法測定細胞活性，以第3代細胞應用流式細胞術鑒定細胞免疫表型。 結果：1細胞形態(tài)：鏡下可見貼壁細胞呈長梭形，無序生長，可呈渦旋狀生長。2免疫表型鑒定：應用流式細胞術對大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質干細胞進行免疫表型鑒定。結果顯示：CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽性表達，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達。3統(tǒng)計結果分析(由于膠原酶Ⅳ消化法無一例成功，則不做分析)。3.1首次融合時間：大塊平鋪法(17.81±0.85d)明顯早于傳統(tǒng)組織塊法(24.89±0.97d)，差異有顯著性（P＜0.05），但明顯晚于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法(7.35±0.61d)，，差異有顯著性（P＜0.05）。3.2穩(wěn)定傳代：大塊平鋪法(11.08±0.74代)與傳統(tǒng)組織塊法(11.04±0.77代)無明顯差別，差異無顯著性（P＞0.05），但明顯長于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法(6.82±0.64代)，差異有顯著性（P＜0.05）。3.3細胞活性：大塊平鋪法(90.84±0.83%)與傳統(tǒng)組織塊法(90.67±0.88%)無明顯差別，不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法(75.06±0.90%)，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3.4成功率：大塊平鋪法與傳統(tǒng)組織塊法差異無顯著性（P＞0.0167），但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法，差異有顯著性（P＜0.0167）。 結論：1臍帶華通膠組織是人間充質干細胞的重要來源。2應用大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法三種方法可成功培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，而應用膠原酶Ⅳ消化法則很難成功培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，原因在于華通膠組織中含有大量的透明質酸，單用膠原酶Ⅳ很難消化完全，需添加透明質酸酶聯(lián)合消化方可行。3鏡下可見人臍帶間充質干細胞呈長梭形貼壁生長，可呈無序生長，呈渦旋狀生長。4大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法培養(yǎng)的人臍帶間充質干細胞均可穩(wěn)定傳代、凍存、復蘇，復蘇后細胞增殖穩(wěn)定。5大塊平鋪法實驗操作上省去了剪碎以及鋪塊等最為繁瑣的過程，比傳統(tǒng)組織塊法更為簡便，而以往研究表明，酶消化法操作繁瑣，不如傳統(tǒng)組織塊法簡單。膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法是酶消化法的一種，同樣操作繁瑣，大塊平鋪法操作明顯較膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法簡單，且原代培養(yǎng)獲得MSCs的時間要短于傳統(tǒng)組織塊法，提高了獲得人臍帶間充質干細胞的效率；以往研究表明，傳統(tǒng)組織塊法培養(yǎng)的人臍帶間充質干細胞細胞活性要優(yōu)于酶消化法，而大塊平鋪法細胞活性與傳統(tǒng)組織塊法無差別，明顯優(yōu)于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法；大塊平鋪法培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞的成功率與傳統(tǒng)組織塊法無差別，且明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法。6應用流式細胞術檢測大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質干細胞免疫表型表明：CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽性表達，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達，符合間充質干細胞的免疫表型。 因此大塊平鋪法是一種簡單、實用的原代培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞的方法,本研究為再生醫(yī)學以及實驗研究提供了一種新的培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞的方法。
【關鍵詞】：人臍帶間充質干細胞 培養(yǎng) 大塊平鋪法 簡單實用 流式細胞術
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 前言9-10
• 材料與方法10-15
• 結果15-17
• 附圖17-23
• 附表23-24
• 討論24-27
• 結論27-28
• 參考文獻28-32
• 綜述 人間充質干細胞的特性、臨床應用及前景32-42
• 參考文獻37-42
• 致謝42-43
• 個人簡歷43

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：1093076