發(fā)布時間：2017-10-24 13:36

  本文關(guān)鍵詞：斑馬魚腎臟疾病和再生模型的構(gòu)建及初步研究

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【摘要】：腎臟是人體的重要器官,發(fā)育自中間中胚層,發(fā)揮著從血液中濾過代謝廢物并維持體內(nèi)正常酸堿和滲透壓平衡的重要作用。在脊椎動物中,腎臟的最小功能單位是腎單元,包括濾過性功能的腎小球,再吸收功能的腎小管以及運輸和排泄功能的收集管。當腎單元發(fā)育缺陷或大多數(shù)腎單元結(jié)構(gòu)損傷時,腎臟功能不能正常發(fā)揮,引發(fā)多種腎臟疾病。腎臟疾病具有病因復雜、并發(fā)癥多、發(fā)病人群廣泛等特點,臨床上的檢測方法包括測量血中氮含量或尿中蛋白含量。多數(shù)腎臟疾病發(fā)展到晚期形成終末期腎衰竭,血液透析或腎臟移植是臨床上常用的治療手段。腎臟如何進行損傷后再修復對于探索腎臟疾病的臨床治療十分重要。有報道顯示在哺乳動物成年腎臟中存在腎臟損傷后再修復的證據(jù),但是關(guān)于腎臟損傷后再修復的機制仍然知之甚少。因此,腎臟發(fā)育的分子調(diào)控、腎臟疾病的致病機制及腎臟損傷后再修復的分子生物學機制是近年來腎臟領(lǐng)域研究的熱點。斑馬魚是新興的模式動物,具有體外受精、胚胎透明和遺傳操作方便等獨特優(yōu)勢。本研究中,我們以斑馬魚為模式動物著手腎臟發(fā)育、疾病和再生展開研究。主要研究議題為：1,構(gòu)建斑馬魚腎臟濾過性模型；2,斑馬魚腎.臟前腎管突變體的遺傳篩選及初步研究；3,構(gòu)建斑馬魚腎臟再生模型。斑馬魚腎臟濾過性模型的構(gòu)建對于體外實時監(jiān)測斑馬魚腎臟濾過性功能,評估腎臟健康狀況具有十分重要的意義；基于斑馬魚腎臟前腎管突變體遺傳篩選和機制研究,有助于深入了解斑馬魚腎臟發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡和腎臟疾病的致病機制,進而可能為人類腎臟發(fā)育和疾病的研究提供間接理論參考;構(gòu)建斑馬魚腎臟再生模型為腎臟再生機制研究和腎臟再生的正向遺傳篩選提供了實驗材料。本研究第一部分中,我們通過建立一系列斑馬魚腎臟特異性表達基因的轉(zhuǎn)基因品系。具體來說包括：腎小球特異性表達基因podocin轉(zhuǎn)基因品系Tg(podocin:eGFP)和Tg(podocin: dsRed);腎臟早期發(fā)育決定基因pax2a轉(zhuǎn)基因品系Tg(pax2a:eGFP)前腎管特異性表達基因cdh17和enpep的轉(zhuǎn)基因品系Tg(cdh17:eGFP), Tg(cdhl7:dsRed)和Tg(enpep:dsRed)。最終,我們將這些轉(zhuǎn)基因品系與實驗室已有的血管轉(zhuǎn)基因品系Tg(flkl:mcherry)雜交,初步實現(xiàn)了體外實時監(jiān)測斑馬魚腎臟濾過性功能的模型。本研究第二部分中,我們對262個ENU誘變突變基因組的F2家族進行遺傳篩選,具體為在突變基因組自交家族后代胚胎3.5dpf時,通過APStaining方法對斑馬魚腎臟前腎管染色,顯微鏡下觀察斑馬魚前腎管表型。最終,我們在30個突變基因組自交家族中找到了57對斑馬臟前腎管疑似突變體,結(jié)合疑似突變體前腎管表型對疑似突變體進行了簡單的表型歸類。具體為：1,突變體前腎管發(fā)育遲緩或缺陷；2,突變體前腎管遷移異�；蛉毕�；3,突變體前腎管膨脹。在這些突變體中,我們注意到一個非常有意思的前腎管膨脹表型突變體V3-5。經(jīng)過突變體表型深入分析,同時結(jié)合已有的相關(guān)報道,我們推測V3-5突變體前腎管膨脹表型是腎臟囊腫疾病的前期表現(xiàn)。目前,我們正在著手尋找V3-5突變體的致變基因。本研究第三部分中,我們利用NTR/Mtz系統(tǒng),成功構(gòu)建了斑馬魚腎臟特異性表達基因podocin和cdh17的斑馬魚腎臟再生模型,為未來斑馬魚腎臟再生機制研究和腎臟再生正向遺傳篩選提供了實驗材料。通過本研究,最終我們：1,初步建成了斑馬魚腎臟濾過性功能監(jiān)測模型；2,遺傳篩選獲得了多種斑馬魚前腎管突變體；3,成功構(gòu)建了斑馬魚腎臟再生模型。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚 ENU誘變篩選 腎臟濾過性 腎臟疾病 腎臟再生
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R692;R-332
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 第一部分 文獻綜述11-21
• 前言11
• 1.1 腎臟發(fā)育11-15
• 1.1.1 中胚層的起源11-12
• 1.1.2 哺乳動物腎臟的形態(tài)發(fā)生12-13
• 1.1.3 斑馬魚腎臟的形態(tài)發(fā)生13-14
• 1.1.4 腎臟形態(tài)建成的基因調(diào)控14-15
• 1.2 腎臟疾病15-17
• 1.2.1 慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease,CKD)15-16
• 1.2.2 急性腎臟損傷(Acute kidney injury,AKI)16
• 1.2.3 遺傳型腎臟疾病(Genetic kidney diseases)16-17
• 1.2.4 腎小球濾過率(GFR)17
• 1.2.5 蛋白尿(Proteinuria)17
• 1.3 腎臟再生17-18
• 1.3.1 斑馬魚再生模型17-18
• 1.4 ENU篩選18-19
• 1.5 tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)19-21
• 第二部分 材料和方法21-31
• 2.1 實驗動物21
• 2.2 試劑、耗材和儀器21
• 2.3 試劑配置21-25
• 2.3.1 LB培養(yǎng)基的制備22
• 2.3.2 原位雜交相關(guān)溶液22-23
• 2.3.3 其他溶液23-24
• 2.3.4 大腸桿菌E.coli化學感受態(tài)細胞的制備24
• 2.3.5 Taq DNA polymerase的制備與提純24-25
• 2.4 質(zhì)粒和菌株25
• 2.5 實驗方法25-31
• 2.5.1 斑馬魚基因組DNA提取25-26
• 2.5.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建26-27
• 2.5.3 反義RNA探針的制備27-28
• 2.5.4 全胚RNA原位雜交(Whole Mount RNA in situ hybridization)28
• 2.5.5 斑馬魚前腎腎管染色(AP Staining)28-29
• 2.5.6 全胚免疫組化(Whole Mount Immunohistochemistry,IHC)29
• 2.5.7 胚胎顯微注射29-30
• 2.5.8 轉(zhuǎn)基因品系的鑒定30-31
• 第三部分 實驗結(jié)果31-47
• 3.1 腎小球濾過性模型的構(gòu)建31-36
• 3.1.1 腎小球足細胞特異表達基因podocin31-33
• 3.1.2 前腎早期發(fā)育決定基因pax2a33-34
• 3.1.3 前腎管特異性表達基因cdh1734-35
• 3.1.4 前腎管特異性表達基因enpep35-36
• 3.2 斑馬魚前腎管突變體的ENU遺傳篩選36-43
• 3.2.1 斑馬魚前腎管發(fā)育缺陷突變體36-37
• 3.2.2 斑馬魚前腎管膨脹突變體37-39
• 3.2.3 V3-5前腎管膨脹突變體表型深入分析及致變基因初探39-43
• 3.3 斑馬魚腎臟再生模型的構(gòu)建43-47
• 3.3.1 斑馬魚腎管特異性表達基因podocin再生模型43-44
• 3.3.2 斑馬魚腎管特異性表達基因cdh17再生模型44-47
• 第四部分 討論和分析47-49
• 參考文獻49-53
• 致謝53

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：1089001