本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲兩種酪氨酸酶的研究

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【摘要】：血吸蟲病廣泛流行于全世界76個國家和地區(qū),是一種重要的人獸共患寄生蟲病,蟲卵是其主要的致病因素。我國流行的是日本血吸蟲病。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為藥物和疫苗結(jié)合使用是長期有效控制血吸蟲病的策略。目前治療血吸蟲病的藥物主要有吡喹酮和青蒿素兩種,品種單一而且治病機(jī)制不明確,長期使用將會導(dǎo)致抗藥性的出現(xiàn)；另一方面,臨床上尚缺乏有效防治血吸蟲病的疫苗。因此,亟待發(fā)現(xiàn)有效的抗血吸蟲疫苗和新藥物,其前提是新疫苗和藥物靶點(diǎn)的發(fā)掘。 酪氨酸酶(Tyrosinase)在吸蟲類動物產(chǎn)卵過程中發(fā)揮著重要的作用。在本研究中,從日本血吸蟲基因庫中,檢索出編碼兩種酪氨酸酶蛋白(SjTYR1,SjTYR2)的編碼序列。使用生物信息學(xué)方法對序列進(jìn)行分析并與其他物種同源蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析。編碼兩種酪氨酸酶的序列中都具有典型的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域,包括兩個銅離子結(jié)合區(qū)和一個高度保守的半胱氨酸富集區(qū)。與其他物種同源蛋白序列聯(lián)配分析結(jié)果顯示,與人源的同源序列相似度較低(僅為24%),可作為潛在的藥物靶點(diǎn)。使用Real-time PCR分析不同時期的雌雄蟲體內(nèi)兩種酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄差異,結(jié)果顯示,不同時期的雄蟲體內(nèi)兩種酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄水平均維持在接近于零的水平；在雌蟲體內(nèi),兩種酪氨酸酶從24天開始出現(xiàn)激增,至28天轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)相對最高值。對兩種酪氨酸酶進(jìn)行了體外重組表達(dá),將SjTYR1, SjTYR2勺全長序列插入到pSJ2載體中,使用大腸桿菌Rosetta Gami(DE3)進(jìn)行表達(dá),獲得不可溶蛋白,除了全長蛋白表達(dá)外,SjTYR1,SjTYR2均出現(xiàn)較小分子量的蛋白表達(dá),經(jīng)質(zhì)譜鑒定后為目的片段的截短表達(dá)蛋白；使用鎳柱純化后溶解于8M尿素中,獲得純度較高的重組蛋白。使用SjTYR1,SjTYR2重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,利用間接ELISA法測定兩組重組蛋白的免疫兔血清的抗體滴度,抗體滴度值均達(dá)到1：512000,使用Western blot檢測SjTYR1,rSjTYR2均具有很好的免疫原性,并且檢測出rSjTYR2的兔多抗對SjTYR1也能識別,rSjTYR1的兔多抗對SjTYR2的全長表達(dá)片段能夠識別,對截短表達(dá)片段不能識別。使用制備的抗rSjTYR1,rSjTYR2兔多抗對蟲體蛋白進(jìn)行Western blot檢測,抗rSjTYR1兔多抗能夠識別出大小約為100KDa勺目標(biāo)片段,預(yù)測蟲體內(nèi)酪氨酸酶以二聚體的形式存在。使用重組蛋白免疫小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗研究,結(jié)果顯示,經(jīng)rSjTYR1免疫后的小鼠減蟲率達(dá)到31.4%,減卵率達(dá)到了52.1%；經(jīng)rSjTYR2免疫后的小鼠減蟲率達(dá)到29.5%,減卵率為8.4%。使用RNA干擾的方法對兩種酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的功能進(jìn)行進(jìn)一步探究,化學(xué)合成的siRNA對日本血吸蟲進(jìn)行體外浸泡法進(jìn)行干擾7天后,使用RT-PCR檢測SjTYR1和SjTYR2的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示siTyr1-1和siTyr2-1有較明顯的干擾效果,使用SjTYR1和SjTYR2勺干擾片段同時進(jìn)行干擾時效果更為明顯,形態(tài)學(xué)上均未觀察到干擾效果。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 酪氨酸酶 Real-time PCR 轉(zhuǎn)錄特異性 免疫保護(hù) RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：S852.7;R383.24
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 研究背景13-21
• 1.1 血吸蟲及血吸蟲病研究概況13-17
• 1.1.1 血吸蟲病的分類及地理分布13
• 1.1.2 日本血吸蟲的生活史及致病機(jī)理13-14
• 1.1.3 日本血吸蟲的流行現(xiàn)狀14-15
• 1.1.4 血吸蟲病的研究現(xiàn)狀15-16
• 1.1.5 日本血吸蟲的發(fā)育和產(chǎn)卵機(jī)制16
• 1.1.6 酪氨酸酶的分布及作用16-17
• 1.2 研究方法17-19
• 1.2.1 生物信息學(xué)方法17
• 1.2.2 RT-PCR技術(shù)17-18
• 1.2.3 RNA干擾技術(shù)18-19
• 1.3 研究內(nèi)容及研究意義19
• 1.3.1 研究內(nèi)容19
• 1.3.2 研究意義19
• 1.4 研究的技術(shù)路線19-21
• 第2章 日本血吸蟲兩種酪氨酸酶(Tyrosinase1,Tyrosinase2)的生物信息學(xué)分析21-26
• 2.1 實(shí)驗方法21
• 2.2 實(shí)驗結(jié)果21-24
• 2.2.1 SjTYR1和SjTYR2的基因序列分析21-22
• 2.2.2 SjTYR1和SjTYR2的氨基酸序列分析22
• 2.2.3 SjTYR1和SjTYR2蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測22
• 2.2.4 SjTYR1和SjTYR2的氨基酸同源序列比對分析及系統(tǒng)分子進(jìn)化樹的構(gòu)建22-24
• 2.3 小節(jié)與討論24-26
• 第3章 日本血吸蟲兩種酪氨酸酶(Tyrosinase1,Tyrosinase2)原核重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)和純化26-41
• 3.1 實(shí)驗材料及實(shí)驗儀器,試劑26-28
• 3.1.1 實(shí)驗材料26
• 3.1.2 實(shí)驗儀器26-27
• 3.1.3 實(shí)驗試劑27
• 3.1.4 常用溶液及試劑的配方27-28
• 3.2 實(shí)驗方法28-35
• 3.2.1 分子克隆28-31
• 3.2.2 重組蛋白的小量表達(dá)31-32
• 3.2.3 重組蛋白的大量表達(dá)及純化32-33
• 3.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡(Westen Blot)分析33-34
• 3.2.5 PAGE膠割膠回收蛋白34
• 3.2.6 質(zhì)譜測序分析鑒定蛋白34-35
• 3.3 實(shí)驗結(jié)果35-40
• 3.3.1 SjTYR1和SjTYR2的PCR擴(kuò)增結(jié)果35
• 3.3.2 pSJ2/SjTYR1和pSJ2/SjTYR2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和驗證35-36
• 3.3.3 重組蛋白的小量表達(dá)36-37
• 3.3.4 重組蛋白SjTYR1,SjTYR2的Western blot及質(zhì)譜鑒定37-39
• 3.3.5 重組蛋白的大量表達(dá)與純化39-40
• 3.4 小節(jié)與討論40-41
• 第4章 日本血吸蟲兩種酪氨酸酶(Tryrosinase1,Tyrosinase2)兔多克隆抗體的制備與免疫原性分析41-48
• 4.1 實(shí)驗材料及實(shí)驗儀器,試劑41-42
• 4.1.1 實(shí)驗材料41
• 4.1.2 實(shí)驗儀器41
• 4.1.3 實(shí)驗試劑41-42
• 4.2 實(shí)驗方法42-43
• 4.2.1 rSjTYR1和rSjTYR2多克隆抗體的制備42
• 4.2.2 兔多克隆抗體的純化42
• 4.2.3 間接ELISA法評價多克隆抗體滴度實(shí)驗42-43
• 4.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)分析重組蛋白的免疫原性43
• 4.3 實(shí)驗結(jié)果43-47
• 4.3.1 rSjTYR1和rSjTYR2多克隆抗體的制備43
• 4.3.2 間接ELISA法評價多克隆抗體滴度實(shí)驗43-44
• 4.3.3 蛋白質(zhì)免疫印跡分析44-47
• 4.4 小節(jié)與討論47-48
• 第5章 日本血吸蟲兩種酪氨酸酶在日本血吸蟲成熟階段的轉(zhuǎn)錄特異性分析48-55
• 5.1 實(shí)驗材料與實(shí)驗儀器,試劑48
• 5.1.1 實(shí)驗材料48
• 5.1.2 實(shí)驗儀器48
• 5.2 實(shí)驗方法48-51
• 5.2.1 日本血吸蟲的感染實(shí)驗49
• 5.2.3 不同時期日本血吸蟲的獲取49
• 5.2.4 日本血吸蟲總RNA的抽提49-50
• 5.2.5 日本血吸蟲總RNA的反轉(zhuǎn)錄50-51
• 5.3 實(shí)驗結(jié)果51-54
• 5.3.1 日本血吸蟲不同時期的蟲體總RNA的濃度及質(zhì)量測定51
• 5.3.2 SjTYR1基因和SjTYR2基因的轉(zhuǎn)錄特異性分析51-54
• 5.4 小節(jié)與討論54-55
• 第6章 日本血吸蟲兩種重組酪氨酸酶蛋白的免疫保護(hù)實(shí)驗55-58
• 6.1 實(shí)驗材料與實(shí)驗儀器,試劑55
• 6.1.1 實(shí)驗材料55
• 6.1.2 實(shí)驗儀器55
• 6.1.3 實(shí)驗試劑55
• 6.2 實(shí)驗方法55-56
• 6.2.1 分組設(shè)置及免疫方案55-56
• 6.2.2 取血方案56
• 6.2.3 日本血吸蟲尾蚴攻擊56
• 6.2.4 免疫保護(hù)效果評價56
• 6.3 實(shí)驗結(jié)果56-57
• 6.4 小節(jié)與討論57-58
• 第7章 利用RNA干擾技術(shù)分析酪氨酸酶(Tyrosinase1,Tyrosinase2)的功能58-66
• 7.1 實(shí)驗材料與實(shí)驗儀器,試劑58-59
• 7.1.1 實(shí)驗材料58
• 7.1.2 實(shí)驗儀器58
• 7.1.3 實(shí)驗試劑58-59
• 7.2 實(shí)驗方法59-62
• 7.2.1 化學(xué)合成siRNA干擾實(shí)驗59
• 7.2.2 雙鏈RNA(dsRNA)法干擾實(shí)驗59-62
• 7.3 實(shí)驗結(jié)果62-65
• 7.3.1 化學(xué)合成siRNA干擾實(shí)驗62-63
• 7.3.2 dsRNA法干擾實(shí)驗63-65
• 7.4 小節(jié)與討論65-66
• 第8章 結(jié)論與展望66-68
• 8.1 結(jié)論66-67
• 8.2 展望67-68
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 致謝73-74

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 雷正龍;鄭浩;張利娟;朱蓉;郭家鋼;李石柱;王立英;陳朝;周曉農(nóng);;2010年全國血吸蟲病疫情通報[J];中國血吸蟲病防治雜志;2011年06期

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本文編號：1088134