本文關(guān)鍵詞：復(fù)制型乙型肝炎病毒載體表達(dá)病毒白細(xì)胞介素10建立小鼠感染模型

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【摘要】：自從1963年Blumberg發(fā)現(xiàn)澳大利亞抗原以來,乙型肝炎病毒(HBV)感染一直是嚴(yán)重威脅人類健康的原因之一。慢性HBV感染所引起的慢性乙型病毒性肝炎及其相關(guān)疾病(如肝衰竭、肝硬化、肝癌等)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前尚無可靠的HBV動(dòng)物模型,嚴(yán)重阻礙了HBV相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究。因此,建立易獲取、經(jīng)濟(jì)適用、生物學(xué)背景清晰的小動(dòng)物HBV感染模型尤為重要。小鼠是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,但是,乙肝病毒的種屬特異性使得正常情況下HBV不能感染小鼠。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型、人鼠嵌合小鼠HBV模型目前己經(jīng)在一定范圍內(nèi)得到應(yīng)用,但是這些模型的制備技術(shù)要求較高、制備難度大、免疫缺陷和肝細(xì)胞來源困難等因素也限制了其應(yīng)用。水動(dòng)力學(xué)方法建立的HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型為HBV相關(guān)研究提供了很好的動(dòng)物模型,該模型制備具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、簡(jiǎn)單易行等優(yōu)點(diǎn),尤其適用于HBV感染免疫發(fā)病機(jī)制、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、抗病毒藥物篩選等方面的研究。多種病毒通過發(fā)展各自的策略逃避宿主免疫,從而形成宿主的慢性感染。很多病毒的基因產(chǎn)物可以減輕宿主的免疫反應(yīng),避免免疫監(jiān)視與免疫清除,為病毒的持續(xù)存在提供良好的環(huán)境,從而成功地感染具有健全免疫系統(tǒng)的機(jī)體,實(shí)現(xiàn)與宿主共存。人皰疹病毒中的人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)和EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)都可以編碼病毒白細(xì)胞介素10(interleukin10,IL-10)類似物,這些IL-10類似物主要是抑制局部的免疫反應(yīng),以增強(qiáng)病毒復(fù)制、播散并持續(xù)存在。本研究擬借用人巨細(xì)胞病毒和EB病毒的生存策略,通過制備表達(dá)人巨細(xì)胞病毒白細(xì)胞介素10(Human Cytomegalovirus interleukin10,cmvIL-10)、EB病毒白細(xì)胞介素10(Epstein-Barr virus interleukin10,ebvIL-10)的復(fù)制型HBV載體,用水動(dòng)力學(xué)的方法探討建立小鼠HBV慢性感染模型的可行性。第一部分表達(dá)cmvIL-10、ebvIL-10的復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建目的:把HBV改造為表達(dá)cmvIL-10、ebvIL-10的復(fù)制型HBV載體,分析其分子生物學(xué)特性及對(duì)小鼠免疫功能是否有抑制作用。方法:1應(yīng)用基因重組技術(shù),構(gòu)建了如下2個(gè)質(zhì)粒:pCH-cmvIL-10、pCH-ebvIL-10。以表達(dá)野生型HBV的質(zhì)粒pCH-3093為母質(zhì)粒,插入外源基因cmvIL-10和ebvIL-10,構(gòu)建表達(dá)人巨細(xì)胞病毒白細(xì)胞介素10(cmvIL-10)的質(zhì)粒pCH-cmvIL-10、表達(dá)EB病毒白細(xì)胞介素10(ebvIL-10)的質(zhì)粒pCH-ebvIL-10。2復(fù)制型HBV載體分子生物學(xué)特性的觀察:上述重組型HBV質(zhì)粒以表達(dá)野生型HBV的質(zhì)粒pCH-3093為對(duì)照,分別轉(zhuǎn)染至Hep G2細(xì)胞中,提取細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中的DNA,Southern blot檢測(cè)HBV的復(fù)制能力,Northern blot檢測(cè)HBV m RNA表達(dá)的變化。Native western blot檢測(cè)HBV核心蛋白的表達(dá)。3兩種病毒IL-10對(duì)小鼠免疫功能的抑制活性檢測(cè)pCH-cmvIL-10、pCH-ebvIL-10和pCH-3093(對(duì)照)分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,收集含IL-10的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。分離小鼠外周血單核細(xì)胞,給予LPS刺激,同時(shí)給予含有病毒IL-10的細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)單核細(xì)胞內(nèi)MHC-II m RNA和TNF-αm RNA的表達(dá),以觀察兩種病毒IL-10對(duì)小鼠免疫功能的抑制作用。結(jié)果:1本研究將HBV的P和C基因重疊區(qū)域分開,通過插入外源基因cmvIL-10、ebvIL-10,利用2個(gè)IRES序列,成功構(gòu)建了表達(dá)cmvIL-10和ebvIL-10的復(fù)制型HBV載體質(zhì)粒pCH-cmvIL-10、pCH-ebvIL-10,經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定,與理論設(shè)計(jì)相同。2為觀察構(gòu)建的2種HBV載體的復(fù)制能力,通過Southern blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)此兩個(gè)質(zhì)粒復(fù)制能力與野生型HBV相比,略有下降。3為觀察2種HBV載體mRNA表達(dá)水平變化,通過Northern blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)兩種HBV載體由于外源基因的插入,pg RNA電泳較野生型HBV稍慢,sg RNA與野生型HBV一致。4為觀察兩種HBV載體是否對(duì)HBV核心蛋白有影響,通過Native western blot檢測(cè),證實(shí)所構(gòu)建的上述HBV載體對(duì)核心蛋白表達(dá)無影響,與野生型HBV一致。5為觀察兩種病毒IL-10對(duì)小鼠免疫功能的抑制活性,通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),小鼠單核細(xì)胞內(nèi)MHCII m RNA和TNF-αm RNA的表達(dá)與對(duì)照組相比有不同程度的下降,表明兩種病毒IL-10在細(xì)胞水平對(duì)小鼠免疫功能的有抑制作用。結(jié)論:1把HBV的P和C基因重疊區(qū)域分開,通過插入外源基因cmvIL-10、ebvIL-10,利用2個(gè)IRES序列,分別用于表達(dá)外源基因和P蛋白,成功構(gòu)建了可表達(dá)cmvIL-10、ebvIL-10的復(fù)制型HBV載體,且對(duì)HBV分子生物學(xué)特性無明顯影響。2本研究所構(gòu)建的2種復(fù)制型HBV載體在細(xì)胞水平對(duì)小鼠免疫功能均有抑制作用。第二部分利用水動(dòng)力學(xué)方法制備重組HBV小鼠感染模型目的:水動(dòng)力學(xué)方法構(gòu)建重組HBV的小鼠HBV感染模型。方法:1將清潔喂養(yǎng)、體重為22-25g、6-8周齡的Balb/c雄性小鼠,隨機(jī)等分為三組:1.pCH3093組;2.pCH-cmvIL-10組;3.pCH-ebvIL-10組。每組32只。2采用水動(dòng)力注射法,每只動(dòng)物給予15ug質(zhì)粒,加入總體積為0.l ml/g(體重)的生理鹽水中,5-7秒鐘內(nèi)通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。3按照以下時(shí)間點(diǎn):注射后第l、3、5、7、10、14、21、28、60天,每個(gè)時(shí)相點(diǎn)每組隨機(jī)取3只小鼠眼眶取血并取肝組織,測(cè)定如下指標(biāo):(1)ELISA測(cè)定小鼠血清中HBs Ag、HBe Ag;(2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝組織中的HBcAg的表達(dá)。結(jié)果:水動(dòng)力法注射HBV重組質(zhì)粒pCH-ebvIL-10后,能夠在小鼠肝組織中檢測(cè)到較高水平的HBc Ag,并能在小鼠血清中檢測(cè)到HBs Ag和HBe Ag,且與野生型HBV組相比,感染時(shí)間有所延長(zhǎng)。而pCH-cmvIL-10組HBV在肝組織及血清中的表達(dá)均較弱。結(jié)論:表達(dá)ebvIL-10的復(fù)制型HBV載體pCH-ebvIL-10可用于構(gòu)建小鼠HBV感染模型,較野生型HBV感染時(shí)間有所延長(zhǎng)。
【關(guān)鍵詞】：cmvIL-10 ebvIL-10 HBV感染 小鼠 動(dòng)物模型 水動(dòng)力法
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.62;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫12-14
• 引言14-16
• 第一部分 表達(dá)cmvIL-10、ebvIL-10 的復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建16-45
• 前言16-18
• 材料與方法18-32
• 結(jié)果32-34
• 附圖34-40
• 討論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 第二部分 利用水動(dòng)力學(xué)方法制備重組HBV小鼠感染模型45-56
• 前言45-47
• 材料與方法47-48
• 結(jié)果48-49
• 附圖49-52
• 討論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 結(jié)論56-57
• 綜述 病毒編碼的IL-10 類似物及其對(duì)宿主免疫功能的控制57-65
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66

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本文編號(hào)：1071617