發(fā)布時(shí)間：2017-10-19 19:00

  本文關(guān)鍵詞：脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元—骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立

  更多相關(guān)文章： 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 原代培養(yǎng) 成肌細(xì)胞 肌管收縮 共培養(yǎng) 神經(jīng)肌肉接頭

【摘要】：失神經(jīng)喉肌等骨骼肌的再生和功能重建是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)，而神經(jīng)肌肉接頭重建和成肌干細(xì)胞分化融合修復(fù)受損肌纖維是失神經(jīng)骨骼肌再生和功能恢復(fù)的關(guān)鍵。因此，為了更好的研究失神經(jīng)喉肌等骨骼肌的再生機(jī)制，從而為干預(yù)神經(jīng)肌肉再生關(guān)鍵分子事件提供新的治療策略和理論依據(jù)，建立一個(gè)適當(dāng)?shù)捏w外模型顯得至關(guān)重要。而脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)就是其中的關(guān)鍵技術(shù)之一。 目前，大部分已知的神經(jīng)肌肉體外共培養(yǎng)模型均采用含血清培養(yǎng)基，這為體外神經(jīng)肌肉接頭的形成提供了一個(gè)功能性的模型系統(tǒng)，但血清的使用也增加了不必要的變異性，由于使用血清使重復(fù)體外神經(jīng)肌肉共培養(yǎng)體系時(shí)描述和量化所需的最低因素變得不可能，因此，也有人設(shè)計(jì)了新型的無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)用于神經(jīng)肌肉共培養(yǎng)，以促進(jìn)功能性的神經(jīng)肌肉接頭的形成。 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及骨骼肌細(xì)胞的取材也不盡相同，而其中培養(yǎng)體外分離的胚胎神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞便利了對(duì)脊椎動(dòng)物神經(jīng)肌肉接頭發(fā)展過(guò)程的分析，復(fù)制組織型的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用往往很難達(dá)到分離胚胎干細(xì)胞所能達(dá)到的效果。從脊髓外植體獲得的胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或者軸突與骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)，容易形成功能性的突觸，可以達(dá)到很高程度的結(jié)構(gòu)和功能的分化。目前，對(duì)體外神經(jīng)肌肉突觸形成中分離細(xì)胞培養(yǎng)的研究已經(jīng)取得了一些關(guān)鍵性的成果。 在過(guò)去的研究中，，Chen等采用NG108-15/C2C12共培養(yǎng)模型用來(lái)測(cè)定肌管上形成的作為神經(jīng)肌肉接頭形成最早的標(biāo)記物乙酰膽堿受體（AchR）簇集。雖然NG108-15細(xì)胞可以長(zhǎng)出軸突并延伸到附近的肌管，但由于NG108-15細(xì)胞為小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞與大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞之融合細(xì)胞，其特性和功能狀態(tài)都遠(yuǎn)不能完全代替神經(jīng)元原代細(xì)胞，故在共培養(yǎng)3天后，NG108-15細(xì)胞逐漸凋亡，AchR的聚集也明顯降低。亦有研究證明，大鼠神經(jīng)元-肌肉共培養(yǎng)可以形成大量的早期NMJ，并可以檢測(cè)到神經(jīng)元軸突誘導(dǎo)的突觸后膜AchR的聚集，但由于原代骨骼肌衛(wèi)星肌細(xì)胞取材難度較大，純化過(guò)程較為繁雜，培養(yǎng)條件較高且傳至9代后細(xì)胞即出現(xiàn)衰老特征，不能無(wú)限代地進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 因此，本實(shí)驗(yàn)擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)?shù)馗倪M(jìn)，首次采用SD大鼠胎鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元原代細(xì)胞和C2C12細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，在體外建立一個(gè)穩(wěn)定的神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)模型，該共培養(yǎng)操作過(guò)程更為簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，細(xì)胞狀態(tài)佳，存活時(shí)間更久，且更易于分析，從而為進(jìn)一步研究體內(nèi)外神經(jīng)肌肉接頭功能狀態(tài)及再生奠定基礎(chǔ)。 第一部分胚胎大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元原代分離和培養(yǎng) 研究目的：能夠熟練的進(jìn)行原代神經(jīng)細(xì)胞的提取與培養(yǎng)，并進(jìn)行提純和鑒定，以獲取體外形成神經(jīng)肌肉接頭所需的胚胎大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。 材料和方法：取孕15d~16d SD大鼠，取出胚胎大鼠腹側(cè)半脊髓組織，經(jīng)胰酶消化和機(jī)械破碎的方法處理分散成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)差速貼壁法純化運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，置于無(wú)血清限定性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，倒置顯微下觀察神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化，并采用免疫熒光法檢測(cè)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物膽堿乙�；D(zhuǎn)移酶多克隆抗體（ChAT）以鑒定運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。 結(jié)果：孕15d~16d胎鼠易于取材且所得運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量多、狀態(tài)好、細(xì)胞活力旺盛，聯(lián)合Neurobasal+2%B27培養(yǎng)基培養(yǎng)的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞純度高，約為85%，能夠在體外培養(yǎng)條件下存活7~10d左右, ChAT反應(yīng)結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性。 結(jié)論：通過(guò)采用胎齡15d~16d胎鼠脊髓腹側(cè)半聯(lián)合無(wú)血清特定性培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的方法成功分離培養(yǎng)并獲得純度較高的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，ChAT能夠特異性標(biāo)記脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，且培養(yǎng)前5~7天，MNs數(shù)量穩(wěn)定，未見明顯減少，為課題實(shí)施提供可靠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來(lái)源，同時(shí)也為后續(xù)共培養(yǎng)體系的建立在時(shí)間上創(chuàng)造了條件。 第二部分成肌細(xì)胞C2C12體外成肌分化模型的建立 研究目的：完善肌母細(xì)胞C2C12體外培養(yǎng)方法，觀察細(xì)胞增殖、分化、融合成肌的生物學(xué)特性。 材料與方法：體外培養(yǎng)成肌細(xì)胞C2C12，在含10%胎牛血清的增殖培養(yǎng)液(GM)中擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為60%~70%時(shí)，換為含2%馬血清的分化培養(yǎng)液(DM)誘導(dǎo)分化。倒置顯微鏡下觀察各個(gè)階段骨骼肌細(xì)胞的形態(tài)特征變化并拍照。采用免疫熒光法抗肌球蛋白重鏈抗體MHC特異性標(biāo)記肌管。 結(jié)果：體外培養(yǎng)時(shí)，C2C12細(xì)胞匯合至60%~70%時(shí)，換DM誘導(dǎo)分化，即開始逐步相互融合形成肌管細(xì)胞并表達(dá)MHC蛋白，約5d左右形成成熟的肌管，MHC特異性反應(yīng)呈陽(yáng)性。 結(jié)論：成肌細(xì)胞C2C12體外培養(yǎng)時(shí)能夠穩(wěn)定傳代，無(wú)需特殊誘導(dǎo)方法，用含2%馬血清的分化培養(yǎng)液(DM)即可誘導(dǎo)分化形成成熟的肌管細(xì)胞，為共培養(yǎng)體系的建立提供穩(wěn)定的骨骼肌肌管來(lái)源。 第三部分運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立 研究目的：獲得運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)條件，建立運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系，在體外形成神經(jīng)肌肉接頭。 材料與方法： C2C12成肌細(xì)胞株體外擴(kuò)增培養(yǎng)至60%~70%匯合時(shí)，分化培養(yǎng)基（DM）誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)約3d，開始分化融合形成肌管。取孕15d~16dSD大鼠，提取胚胎大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞，種植到分化5d的肌管細(xì)胞中，含2%馬血清的分化培養(yǎng)液(DM)共培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察各個(gè)階段神經(jīng)元形態(tài)及突起長(zhǎng)度的變化、肌管形態(tài)特征變化及收縮特性、神經(jīng)肌肉接頭的形成。通過(guò)活體細(xì)胞孵育alpha--BTX)觀察突觸后膜AchR的位置及分布，并采用屏幕錄像技術(shù)記錄共培養(yǎng)中肌肉收縮現(xiàn)象，這從另一個(gè)方面證明共培養(yǎng)后NMJ的形成。 結(jié)果：更換為共培養(yǎng)培養(yǎng)基后，SKMs和MNs均能存活并進(jìn)一步地分化成熟。在共培養(yǎng)細(xì)胞中，MNs在形態(tài)學(xué)上易于鑒別，共培養(yǎng)約4h后，倒置顯微鏡下可觀察到部分脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元開始貼壁，呈單個(gè)圓形或橢圓形，12h后，大部分細(xì)胞均已貼壁，24h后, MNs胞體逐漸形成突起，肌管細(xì)胞進(jìn)一步融合增粗并相互形成網(wǎng)絡(luò)狀，第3d~5d,神經(jīng)元生長(zhǎng)旺盛、胞體飽滿、光暈明顯、突起增多并延長(zhǎng)，部分MNs開始與肌管細(xì)胞形成連接；約1周左右可見MNs伸出的軸突延伸至肌管膜表面或包繞肌管，肌管按同一方向排列，出現(xiàn)廣泛地節(jié)律性收縮；共培養(yǎng)約10d后，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元開始凋亡，肌管細(xì)胞逐漸出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象。 結(jié)論：在體外培養(yǎng)條件下，無(wú)需特殊培養(yǎng)基和各種營(yíng)養(yǎng)因子，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞即可共同生存、生長(zhǎng)并進(jìn)一步發(fā)育，建立突觸連接，觸發(fā)一系列神經(jīng)肌肉接頭信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)肌管節(jié)律性收縮。
【關(guān)鍵詞】：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 原代培養(yǎng) 成肌細(xì)胞 肌管收縮 共培養(yǎng) 神經(jīng)肌肉接頭
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-14
• 前言14-17
• 參考文獻(xiàn)15-17
• 第一部分 胚胎大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元原代分離和培養(yǎng)17-24
• 一、 前言17-18
• 二、 材料與方法18-20
• （一） 試劑和設(shè)備18-19
• （二） 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源與麻醉19
• （三） 脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)、純化、鑒定19-20
• 三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-22
• （一） 脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化20-21
• （二） 脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)21-22
• 四、 討論22-23
• 參考文獻(xiàn)23-24
• 第二部分 成肌細(xì)胞 C2C12 體外分化成肌模型的建立24-33
• 一、 前言24-25
• 二、 材料和方法25-28
• （一） 試劑和設(shè)備25-26
• （二） C2C12 成肌細(xì)胞株的來(lái)源26
• （三） C2C12 細(xì)胞的增殖培養(yǎng)及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制26-27
• （四） C2C12 細(xì)胞誘導(dǎo)肌分化培養(yǎng)27
• （五） 誘導(dǎo)后 C2C12 細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)27-28
• 三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-30
• （一） C2C12 細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)特性28-29
• （二） DM 誘導(dǎo) C2C12 細(xì)胞形成肌管細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征29-30
• （三） C2C12 細(xì)胞誘導(dǎo)后形成肌管細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)30
• 四、 討論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-33
• 第三部分 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立33-43
• 一、 前言33-34
• 二、 材料和方法34-36
• （一） 試劑和設(shè)備34-35
• （二） 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定35
• （三） 胎鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與 C2C12 肌管細(xì)胞共培養(yǎng)35
• （四） C2C12 細(xì)胞和原代運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)分析35
• （五） 共培養(yǎng)形成 NMJ 的形態(tài)學(xué)觀察和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)35-36
• （六） 共培養(yǎng)體系中肌管收縮的影像記錄36
• 三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-39
• （一） 共培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析36-38
• （二） 共培養(yǎng)形成 NMJ 的形態(tài)學(xué)觀察和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)38
• （三） 證明共培養(yǎng)體系中 NMJ 形成的影像分析38-39
• 四、 討論39-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 全文小結(jié)43-44
• 本課題的創(chuàng)新性44
• 本課題進(jìn)一步研究工作計(jì)劃44-45
• 文獻(xiàn)綜述45-54
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 致謝54

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 孫毅;趙冬梅;張燁;劉洪付;黃飛;;胎鼠前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的取材與培養(yǎng)研究[J];濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2009年06期

2 張颯;王諾;李永蘭;楊朝陽(yáng);李曉光;;免疫熒光電鏡技術(shù)觀察ChAT在脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中超微結(jié)構(gòu)水平上的分布[J];分析儀器;2011年05期

3 文燦;黃河;王晗知;張艷玲;梁亞杰;郭強(qiáng);蘇炳銀;;脊髓腹側(cè)神經(jīng)元的純化培養(yǎng)與鑒定[J];局解手術(shù)學(xué)雜志;2010年06期

4 劉揚(yáng),董振明;神經(jīng)和肌肉共同作用——神經(jīng)肌肉接頭形成及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2005年01期

本文編號(hào)：1062768