本文關(guān)鍵詞：細粒棘球絳蟲果糖二磷酸醛縮酶的生物信息學分析及其表達、純化和酶活性的檢測

  更多相關(guān)文章： 細粒棘球絳蟲 果糖二磷酸醛縮酶(FBPA) 分子克隆 蛋白純化 生物信息學預測

【摘要】：目的：利用生物信息學方法分析細粒棘球絳蟲果糖二磷酸醛縮酶(FBPA)的結(jié)構(gòu)和功能特征,并利用基因工程技術(shù)進行克隆、表達、純化,獲得活性蛋白。 方法：利用多種生物信息學軟件分析細粒棘球絳蟲的FBPA的拓撲結(jié)構(gòu)、生物學以及免疫功能特征等。限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ對重組質(zhì)粒FBPA/P-blue酶切FBPA目的片段,亞克隆入表達載體pET30a,篩選重組克隆并測序,將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細菌,異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達重組蛋白。Ni-NTA柱純化重組蛋白,并建立酶反應體系,通過NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的變化來測定重組蛋白EgFBPA的酶催化活性。 結(jié)果：EgFBPA是一個全長的1092bp的基因,編碼363個氨基酸,軟件分析表明其等電點(PI)為8.34,分子量為39803.5Da。亞細胞定位分析顯示該蛋白是無信號肽的細胞質(zhì)蛋白,屬于穩(wěn)定蛋白。結(jié)構(gòu)域和保守功能域的預測結(jié)果發(fā)現(xiàn)FBPAI的激活位點VYLEGTLLKPN (222aa-232aa)和TIMβ/α筒狀結(jié)構(gòu)(6aa-346aa)。二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和環(huán)狀結(jié)構(gòu)居多,無跨膜區(qū),有10種類型的活性位點。以1ADO A為模板,構(gòu)建出了FBPA的三級結(jié)構(gòu)。經(jīng)PCR (聚合酶鏈反應)、雙酶切和測序證實pET30a (+)-EgFBPA成功構(gòu)建。SDS-PAGE (十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電)證實成功表達重組蛋白,且該蛋白是具有高效表達的可溶性蛋白。Ni-NTA柱子純化后得到純度較高的FBPA, Bradford法測定蛋白濃度為0.50±0.02mg/ml。 結(jié)論：經(jīng)生物信息學預測細粒棘球絳蟲FBPA與人的FBPA的同源性是69%。EgFBPA可能是潛在的藥物靶點。重組質(zhì)粒Pet30a (+)-FBPA在大腸桿菌BL21中成功表達,親和層析純化后獲得較高純度的有活性的蛋白,為進一步研究其生物學功能及其抗體、藥物靶點的研制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：細粒棘球絳蟲 果糖二磷酸醛縮酶(FBPA) 分子克隆 蛋白純化 生物信息學預測
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R383.33;Q78
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 目錄7-9
• 前言9-12
• 第一章 利用EST序列進行生物信息學預測12-27
• 1.1 材料12
• 1.2 方法12-13
• 1.3 結(jié)果13-25
• 1.4 討論25-26
• 1.5 小結(jié)26-27
• 第二章 細粒棘球絳蟲成蟲EgFBPA重組蛋白的誘導表達、純化27-41
• 2.1 材料27-28
• 2.2 方法28-35
• 2.3 結(jié)果35-39
• 2.4 討論39-40
• 2.5 小結(jié)40-41
• 第三章 細粒棘球絳蟲成蟲EgFBPA重組蛋白的酶活性的檢測41-46
• 3.1 材料41
• 3.2 方法41-43
• 3.3 結(jié)果43-44
• 3.4 討論44-45
• 3.5 小結(jié)45-46
• 第四章 結(jié)論46-47
• 4.1 主要結(jié)論46
• 4.2 研究的局限性及展望46-47
• 參考文獻47-52
• 綜述52-55
• 參考文獻54-55
• 在讀期間研究成果55-56
• 致謝56-57
• 英文縮略語表57

【參考文獻】

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本文編號：1060230