本文關(guān)鍵詞：小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定與成肌誘導(dǎo)分化研究

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【摘要】：本研究運(yùn)用Ⅰ型膠原酶消化法分離4周齡雌性ICR小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs),進(jìn)行體外分離培養(yǎng),隨后觀察傳代生長過程中的形態(tài)變化,繪制生長曲線,進(jìn)行染色體分析,和細(xì)胞周期的測定。隨后用RT-PCR法對ADSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的檢測,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD29,CD31,CD44,CD45。結(jié)果顯示小鼠ADSCs體外培養(yǎng)時(shí)呈成纖維細(xì)胞樣,增殖速度快,各代次細(xì)胞經(jīng)歷生長潛伏期、指數(shù)生長期和平臺(tái)期,生長狀態(tài)無異常,細(xì)胞表面標(biāo)志CD29陽性率為95.51%,CD44為31.63%,CD31為20.22%,CD45表達(dá)量極少。RT-PCR檢測ADSCs的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)果表明,小鼠ADSCs少量表達(dá)Oct-4和C-kit,大量表達(dá)Sca-1�？山�(jīng)成脂誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞,經(jīng)過蘇丹黑染色顯藍(lán)色,并表達(dá)PPARy2這一脂肪細(xì)胞分化過程中重要的調(diào)節(jié)因子。可經(jīng)成骨誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞,經(jīng)過茜素紅染色呈紅色,并表達(dá)鈣骨素基因。 用膠原酶和胰酶聯(lián)合消化法消化分離小鼠原代肌肉衛(wèi)星細(xì)胞,該方法比組織塊等方法得到衛(wèi)星細(xì)胞所用時(shí)間短。免疫熒光顯示其表達(dá)FITC標(biāo)記的Myod抗體和Cy3標(biāo)記的Desmin抗體。RT-PCR結(jié)果顯示,小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)MyoD, Myogenin和Myf5等生肌決定因子,其中MyoD的表達(dá)量最高。不同代次之間不同生肌決定因子的表達(dá)量不同,新分離的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和第二代細(xì)胞之間MyoD的表達(dá)量差異并不顯著,而MyoG的表達(dá)量差異顯著,而Myf5的表達(dá)量差異極其顯著,說明骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在傳代生長過程中,迅速地發(fā)生分化,逐漸變?yōu)樯L成熟的成肌細(xì)胞,失去分化增殖能力。 用不同濃度去甲基化試劑5-氮雜胞苷(5-Aza)處理間充質(zhì)干細(xì)胞尋找最佳培養(yǎng)條件后進(jìn)行成肌檢測。免疫熒光結(jié)果表明其定向分化為肌肉細(xì)胞的能力強(qiáng),添加10μmol-L-15-Aza與10%的馬血清(Horse Serum,HS)的條件培養(yǎng)基可使誘導(dǎo)效果更好。誘導(dǎo)后部分相鄰細(xì)胞開始融合,形成類似肌管樣的細(xì)胞,成肌特異性抗體anti-MyoD和anti-Desmin陽性表達(dá)。5-Aza單獨(dú)誘導(dǎo)組、5-Aza與馬血清(HS)協(xié)同誘導(dǎo)組與陰性對照脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)組和陽性對照第一代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SCs)組,RT-PCR結(jié)果表明各組之間生肌決定因子MyoD,Myogenin和Myf5的表達(dá)量有差異,說明其成肌分化的程度不同,并有改善空間。 因此,本研究分離培養(yǎng)得到小鼠ADSCs,該細(xì)胞取材容易,帶入雜質(zhì)細(xì)胞很少,分離方法簡便,體外生長增殖能力強(qiáng),經(jīng)多次傳代后細(xì)胞仍生長穩(wěn)定、增殖速度快、貼壁率高。并且在利用5-Aza以及優(yōu)化的協(xié)同誘導(dǎo)體系可以在較短時(shí)間內(nèi)使其誘導(dǎo)分化為成肌細(xì)胞樣細(xì)胞,并具有表達(dá)生肌的標(biāo)志性蛋白MyoD和肌肉骨架蛋白Desmin的能力,可以作為體外肌組織工程的種子細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞 成肌分化 生肌因子
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 表格索引7-8
• 圖形索引8-11
• 摘要11-13
• ABSTRACT13-15
• 縮略詞15-17
• 引言17-18
• 文獻(xiàn)綜述18-42
• 1 干細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞18-23
• 1.1 干細(xì)胞的定義與分類18-20
• 1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的多能分化特性20-22
• 1.3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與性質(zhì)22-23
• 2 肌肉形成與成肌誘導(dǎo)23-30
• 2.1 胚胎發(fā)育與細(xì)胞分化機(jī)理23-24
• 2.2 骨骼肌細(xì)胞發(fā)育和成肌調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子24-26
• 2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的成肌誘導(dǎo)與機(jī)理26-30
• 3 體外肌肉組織工程30-34
• 3.1 種子細(xì)胞31
• 3.2 支架技術(shù)研究概況31-32
• 3.3 培養(yǎng)條件與生物反應(yīng)器32-33
• 3.4 國內(nèi)外“試管肉”研究組織概況33-34
• 4 結(jié)語34-36
• 參考文獻(xiàn)36-42
• 第一章 小鼠ADSCs的分離、鑒定與生物學(xué)特性研究42-62
• 1 材料與方法42-48
• 1.1 試驗(yàn)材料42-44
• 1.2 試驗(yàn)方法44-48
• 2 結(jié)果與分析48-56
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與形態(tài)48-50
• 2.2 細(xì)胞不同代次的生長曲線50-51
• 2.3 細(xì)胞周期51
• 2.4 染色體分析51-52
• 2.5 小鼠ADSCs的表面標(biāo)志鑒定結(jié)果52-55
• 2.6 鼠ADSCs的成脂染色結(jié)果55-56
• 2.7 小鼠ADSCs的成骨染色結(jié)果56
• 3 討論56-60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 第二章 小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離與鑒定研究62-76
• 1 材料與方法63-66
• 1.1 試驗(yàn)材料63
• 1.2 試驗(yàn)方法63-66
• 2 結(jié)果與分析66-72
• 2.1 培養(yǎng)細(xì)胞生長特性66-67
• 2.2 生長曲線67-68
• 2.3 小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的核型分析68
• 2.4 小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的免疫熒光鑒定68-70
• 2.5 小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的RT-PCR鑒定70-72
• 3 討論72-74
• 參考文獻(xiàn)74-76
• 第三章 小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成肌誘導(dǎo)分化與鑒定76-90
• 1 材料與方法76-79
• 1.1 試驗(yàn)材料76-77
• 1.2 試驗(yàn)方法77-79
• 2 結(jié)果與分析79-86
• 2.1 誘導(dǎo)劑5-Aza的濃度效應(yīng)的測定結(jié)果79-80
• 2.2 ADSCs在最佳誘導(dǎo)濃度中的凋亡檢測80-81
• 2.3 ADSCs經(jīng)過不同誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的變化81-82
• 2.4 ADSCs誘導(dǎo)后免疫熒光檢測82-84
• 2.5 誘導(dǎo)后不同組生肌基因的RT-PCR檢測84-86
• 3 討論86-88
• 參考文獻(xiàn)88-90
• 全文結(jié)論90-92
• 創(chuàng)新說明92-94
• 研究展望94-96
• 附錄96-98
• 致謝98-100
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文100

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1057274