本文關(guān)鍵詞：泛素C末端水解酶UCH-L1在SAMP8小鼠海馬CA1區(qū)的增齡變化及意義

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【摘要】：目的： 泛素C末端水解酶（UCH-L1），是維持正常突觸和認(rèn)知功能所必須的。本研究以SAMP8小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用免疫組織化學(xué)，PCR和WesternBlot等技術(shù)，在mRNA和蛋白水平研究UCH-L1在海馬CA1區(qū)的增齡變化，初步探討UCH-L1、UPP途徑在快速老化過(guò)程及神經(jīng)退行性病變中的作用，充實(shí)腦老化及學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)機(jī)制。 方法： 1動(dòng)物及分組：選用3、6、9、12月齡SAMR1，SAMP8小鼠各10只。 2組織制備及染色觀察：每組取3只小鼠，將小鼠麻醉并暴露心臟，隨后將輸液針刺入左心室，同時(shí)用剪刀挑開右心耳，，迅速用生理鹽水沖洗，至無(wú)血后，用4%多聚甲醛進(jìn)行灌注。取自上丘至視交叉節(jié)段的腦組織，從正中矢狀位分為左右兩半后，常規(guī)制備成石蠟切片，以備抗UCH-L1免疫組化染色，分析各組小鼠海馬的CA1區(qū)光密度；另一半用于Gogli染色，并計(jì)數(shù)各組小鼠海馬CA1區(qū)第2～3級(jí)頂樹突樹突棘密度。 3蛋白提取及SAM系小鼠各器官活性去泛素化酶檢測(cè)，取6月齡SAMP8小鼠一只，6％的水合氯醛麻醉后，迅速取心臟，肝臟，睪丸，海馬，額葉皮質(zhì)。PBS清洗后，迅速置于裂解液中，充分勻漿后冰上靜置30min后12000rpm4℃離心20分鐘，棄沉淀，取上清液，小部分上清液用于蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定），其余部分與HA標(biāo)記活性去泛素化酶探針結(jié)合1小時(shí)，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)各器官上活性去泛素化酶的分布。 4mRNA提取及PCR：每組取3只小鼠，6％水合氯醛麻醉后，在冰上迅速斷頭，去除頂骨，暴露腦組織，PBS清洗后，分離出海馬置于PBS中，迅速轉(zhuǎn)移至Trizol中，常規(guī)提取mRNA，用NanoDrop2000C進(jìn)行定量，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存，用于PCR檢測(cè)。 5蛋白提取及Western Blot：每組取3只小鼠，6％水合氯醛麻醉后，在冰上迅速斷頭，去除頂骨，暴露腦組織，PBS清洗后，分離出海馬置于PBS中，迅速轉(zhuǎn)移置裂解液中，充分勻漿后于冰上靜置30min，12000rpm4℃離心20min，取上清液，棄沉淀，小部分上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定，其余部分上清液置于-80℃冰箱儲(chǔ)存，用于Western Blot檢測(cè)。 結(jié)果: 1SAM系小鼠各器官活性去泛素化酶檢測(cè)：活性去泛素化酶在SAM系小鼠的各器官均有表達(dá)，在海馬中，36kD處有明顯條帶，提示UCH-L1在海馬上有大量活性表達(dá)。 2UCH-L1mRNA PCR表達(dá)情況：6月R1組表達(dá)量大于其他各組，12月P8組小于其它各組；R1組各月齡表達(dá)水平為0.345±0.013，0.770±0.032，0.553±0.020，0.385±0.014，大于其它同月齡SAMP8鼠，分別為0.344±0.014，0.658±0.040，0.388±0.015，0.292±0.017(P0.05)。 3Western Blot結(jié)果：6月SAMR1組海馬組織中UCH-L1表達(dá)豐富，其IOD值為2.224±0.028，明顯高于其他各組（P0.05）；12月SAMP8組海馬組織中有少量的UCH-L1表達(dá)，其IOD值為0.933±0.044，明顯低于其他組（P0.05）。9月SAMR1組的IOD值為1.486±0.032較9月SAMP8組1.085±0.025高（P0.05）；3月SAMR1組和3月SAMP8組IOD值分別為1.280±0.030和1.235±0.012，兩組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4抗UCH-L1免疫組化結(jié)果：6月SAMR1組海馬CA1區(qū)染色深，其光密度值為0.384±0.016，明顯高于其他各組（P0.05）；12月SAMP8組海馬CA1區(qū)染色淺，其光密度值為0.172±0.002，明顯低于其他各組（P0.05）。9月SAMR1組光密度值為0.267±0.011較9月SAMP8組（0.232±0.012）高（P0.05）；12月SAMR1組光密度值為0.234±0.010較12月SAMP8組高（P0.05）。3月SAMR1組海馬CA1區(qū)（0.251±0.006）光密度值與3月SAMP8組海馬CA1區(qū)（0.249±0.011）相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 5Gogli染色結(jié)果：6月SAMR1組海馬CA1區(qū)樹突棘排列密集，樹突棘數(shù)目為1.417±0.064/μm2，明顯高于其它各組（P0.05）；12月SAMP8組樹突棘數(shù)目為0.900±0.029/μm2，明顯低于其它各組（P0.05）；9月SAMR1組樹突棘密度為1.152±0.054/μm2較9月SAMP8組高（P0.05）；12月SAMR1組樹突棘密度為1.006±0.061/μm2較12月SAMP8組高（P0.05）。3月SAMR1組樹突棘密度（1.144±0.042/μm2）與3月SAMP8組樹突棘密度（1.151±0.050/μm2）相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論： 1活性去泛素化酶在SAM系小鼠的各器官中均有表達(dá)，UCH-L1在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)量大。 2在基因水平和蛋白水平上，6、9、12不同的月齡，SAMR1小鼠UCH-L1表達(dá)量高于同月齡的SAMP8小鼠。3月齡組表達(dá)量無(wú)差異。 3在基因水平和蛋白水平上，SAMR1小鼠和SAMP8小鼠的UCH-L1含量隨月齡的增加而減少。 4在6，9，12不同的月齡，SAMR1小鼠樹突棘的數(shù)量要多余同月齡的SAMP8小鼠。3月齡組表達(dá)量無(wú)差異。 5在不同的月齡中，SAMR1小鼠和SAMP8小鼠的樹突棘的數(shù)量隨月齡的增加而減少。
【關(guān)鍵詞】：UCH-L1 AD SAMP8 增齡變化 樹突棘
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 目錄3-4
• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11
• 材料與方法11-18
• 結(jié)果18-20
• 附圖20-25
• 附表25-27
• 討論27-31
• 結(jié)論31
• 參考文獻(xiàn)31-35
• 綜述 泛素蛋白酶體途徑與突觸可塑性35-54
• 參考文獻(xiàn)46-54
• 致謝54-55
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 崔慧先;李莎;顧平;石葛明;;雄激素對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)元的影響[J];解剖學(xué)報(bào);2008年03期

本文編號(hào)：1054022