本文關(guān)鍵詞：單通道雙酶同步測(cè)定及其免疫分析應(yīng)用

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【摘要】：多酶同步分析可顯著提高檢測(cè)效率。已有的用兩種酶標(biāo)記的單通道測(cè)量?jī)山M分的ELISA技術(shù)，并沒有實(shí)現(xiàn)單通道兩種酶同步反應(yīng)和同步檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室建立了基于等吸收波長(zhǎng)原理的單通道雙酶同步分析方法（簡(jiǎn)稱SDESA），并將其成功應(yīng)用于ELISA（簡(jiǎn)稱SDESA-ELISA），該方法在同一體系中，同時(shí)啟動(dòng)并同步監(jiān)測(cè)所有標(biāo)記酶的反應(yīng)。SDESA的技術(shù)關(guān)鍵在于選擇一對(duì)合適的顯色底物和一對(duì)合適的標(biāo)記酶，并建立消除吸收重疊干擾和混合體系中物質(zhì)干擾的數(shù)據(jù)處理方法，從而使SDESA-ELISA的檢測(cè)限、靈敏度及線性范圍與單組份ELISA相當(dāng)。為解決上述問題，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)SDESA進(jìn)行了下列研究： 1.復(fù)雜動(dòng)力學(xué)體系雙酶同步測(cè)定-建立消除干擾的數(shù)據(jù)處理方法 用于單通道雙酶同步測(cè)定的兩種酶需滿足以下要求：（a）酶A作用于底物A生成產(chǎn)物A，酶B作用于底物B生成產(chǎn)物B。產(chǎn)物A的最大差吸收峰（λA）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于產(chǎn)物B的最大差吸收峰（λB），且λB在產(chǎn)物A和底物A的最大等吸收波長(zhǎng)（λ0）附近。（b）λA和λ0處的光吸收值通過快速變換檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行定量，基于吸收的線性加和性消除吸收重疊干擾。（c）通過反應(yīng)曲線動(dòng)力學(xué)分析消除體系中物質(zhì)對(duì)待測(cè)酶的干擾（抑制或激活）。（d）如果底物A的濃度低于其米氏常數(shù)，則選用本實(shí)驗(yàn)室建立的聯(lián)用策略對(duì)酶A進(jìn)行定量。 分析γ-谷氨�；D(zhuǎn)移酶（GGT）和乳酸脫氫酶（LDH）同步測(cè)定的復(fù)雜動(dòng)力學(xué)過程，并以此作為SDESA的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型。GGT作用于γ-谷氨�；�-對(duì)硝基苯胺（GGPNA），釋放出對(duì)硝基苯胺（PNA），PNA最大差吸收峰λA在405nm附近，GGPNA和PNA的最大等吸收波長(zhǎng)λ0在344nm；LDH消耗還原態(tài)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，還原型輔酶Ⅰ），NADH的最大差吸收峰λB在340nm。通過對(duì)反應(yīng)過程的動(dòng)力學(xué)分析，，消除了PNA對(duì)LDH的抑制作用；通過聯(lián)用策略測(cè)定的GGT初速度線性范圍以及消除干擾后的LDH線性范圍都與各自單獨(dú)測(cè)定時(shí)的線性范圍相當(dāng)；當(dāng)一種酶的活力相當(dāng)于另一種酶的25倍時(shí)，活力較低的酶通過SDESA的定量限仍然與單獨(dú)測(cè)定時(shí)相當(dāng)。 2.簡(jiǎn)單動(dòng)力學(xué)體系的雙酶同步測(cè)定及在免疫分析中的應(yīng)用（一） 為了探索SDESA的潛在應(yīng)用價(jià)值，牛小腸堿性磷酸酶（ALP）和β-D-半乳糖苷酶（BGAL）被用作酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）的標(biāo)記酶，用于小分子半抗原的單通道同步測(cè)定。ALP作用于4-硝基-1-萘酚磷酸酯（4NNPP），釋放出4-硝基-1-萘酚（4NNP），4NNP最大差吸收峰λA在458nm，4NNPP和4NNP的最大等吸收波長(zhǎng)λ0在405nm；BGAL作用于對(duì)硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（PNPG），釋放出4-硝基苯酚（4NP），4NP的最大差吸收峰λB在405nm。由于不存在底物或產(chǎn)物間的干擾，ALP和BGAL的組合可用于ELISA同步分析單通道內(nèi)的青霉素G和克倫特羅。結(jié)果表明，任意一個(gè)半抗原同步測(cè)定時(shí)的定量限均與單獨(dú)測(cè)定時(shí)基本相當(dāng)，因此，SDESA具有廣闊的應(yīng)用前景；獲得一對(duì)恰當(dāng)?shù)娘@色底物和一對(duì)適當(dāng)?shù)臉?biāo)記酶是其應(yīng)用于ELISA的關(guān)鍵。 3.簡(jiǎn)單動(dòng)力學(xué)體系的雙酶同步測(cè)定及在免疫分析中的應(yīng)用（二） 通常情況下，糖苷酶之間都具有良好的緩沖液兼容性，且?guī)缀醪淮嬖诘孜锘虍a(chǎn)物的相互干擾。BGAL水解4-硝基-1-萘酚-β-D-半乳糖苷（4NNPG），釋放出4-硝基-1-萘酚（4NNP），4NNP最大差吸收峰λA在458nm左右，4NNPG和4NNP的最大等吸收波長(zhǎng)λ0在400nm；α-D-葡萄糖苷酶（AGLU）作用于對(duì)硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（4NPG），釋放出4-硝基苯酚（4NP），4NP的最大差吸收峰λB在400nm。這種特性使得BGAL和AGLU可作為同步分析ELISA的標(biāo)記酶，通過快速變換檢測(cè)波長(zhǎng)，同時(shí)測(cè)定405nm和450nm的吸收。事實(shí)上，用青霉素G標(biāo)記的BGAL和克倫特羅標(biāo)記的AGLU作為示蹤劑的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，單通道內(nèi)青霉素G和克倫特羅同步測(cè)定的結(jié)果都與單獨(dú)測(cè)定的結(jié)果具有良好的一致性，對(duì)于任意一種半抗原，同步測(cè)定的精密度和回收率均與單獨(dú)測(cè)定時(shí)相當(dāng)。因此，對(duì)一個(gè)作用于底物產(chǎn)生4-硝基-1-萘酚的糖苷酶和另一個(gè)作用于底物產(chǎn)生4-硝基苯酚的糖苷酶進(jìn)行分子工程改造以得到比活力足夠高的酶作為一組標(biāo)記酶，可使得同步分析ELISA成為一種可行的、新型的免疫分析平臺(tái)，該平臺(tái)不僅提高了分析效率，而且可獲得令人滿意的靈敏度。 4.標(biāo)記酶篩選 我們通過以上兩組SDESA-ELISA應(yīng)用實(shí)例得出以下結(jié)論，為獲得良好的檢測(cè)效果，SDESA-ELISA的一對(duì)顯色底物和一對(duì)標(biāo)記酶的選擇需遵循以下幾點(diǎn)原則：（a）一個(gè)顯色底物的最大等吸收波長(zhǎng)應(yīng)該等于或接近405nm，其產(chǎn)物最大吸收峰在450nm或490nm附近，而另一個(gè)顯色底物的產(chǎn)物最大吸收峰應(yīng)在405nm附近，從而保證在最優(yōu)條件下用傳統(tǒng)光度計(jì)進(jìn)行同步檢測(cè)時(shí)，任意一個(gè)顯色產(chǎn)物的定量靈敏度和LOQ都與各自單獨(dú)測(cè)定時(shí)相當(dāng)。（b）一對(duì)合適的標(biāo)記酶應(yīng)該在相同的緩沖液中對(duì)一對(duì)預(yù)先選定的顯色底物具有足夠高的比活力，且耐受來自SDESA體系中物質(zhì)的干擾，從而簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)處理過程。一般來說，一對(duì)標(biāo)記酶的最適緩沖液最好兼容。在Tris-HCl和PBS中，ACHE作用于硫代乙酰膽堿均表現(xiàn)出較高的比活力，因此，ACHE即可與在堿性Tris-HCl緩沖液中表現(xiàn)出高比活的堿性磷酸酶組合又可與以生理pH的磷酸鹽為最適緩沖液的糖苷酶組合用于SDESA。SDESA結(jié)果表明，ECAP和ACHE或BGAL和ACHE的同步測(cè)定中都幾乎不存在體系中物質(zhì)對(duì)酶活力的干擾，表明了SDESA的可行性。
【關(guān)鍵詞】：單通道雙酶同步分析 酶聯(lián)免疫吸附分析 顯色底物 顯色產(chǎn)物 等吸收波長(zhǎng)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 符號(hào)說明5-6
• 摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 前言15-23
• 參考文獻(xiàn)19-23
• 第一部分 復(fù)雜動(dòng)力學(xué)體系的雙酶同步測(cè)定-建立消除干擾的數(shù)據(jù)處理方法23-38
• 材料與方法23-27
• 結(jié)果27-33
• 討論33-36
• 參考文獻(xiàn)36-38
• 第二部分 簡(jiǎn)單動(dòng)力學(xué)體系的雙酶同步測(cè)定用于免疫分析的標(biāo)記酶組合方案（一）38-54
• 材料與方法38-43
• 結(jié)果43-51
• 討論51-53
• 參考文獻(xiàn)53-54
• 第三部分 簡(jiǎn)單動(dòng)力學(xué)體系的雙酶同步測(cè)定用于免疫分析的標(biāo)記酶組合方案（二）54-65
• 材料與方法54-56
• 結(jié)果56-62
• 討論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-65
• 第四部分 標(biāo)記酶組合的繼續(xù)篩選65-70
• 材料與方法65-67
• 結(jié)果67
• 討論67-69
• 參考文獻(xiàn)69-70
• 全文總結(jié)70-71
• 致謝71-72
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文72-73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 勞海苗;吳英松;劉天才;;現(xiàn)代免疫分析方法最新進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2010年10期

本文編號(hào)：1052528