本文關(guān)鍵詞：HECT類泛素連接酶NEDL2與細(xì)胞周期的相關(guān)性研究

  更多相關(guān)文章： 蛋白質(zhì)泛素化 泛素連接酶 NEDL2 細(xì)胞周期調(diào)控 APC/C-Cdh1

【摘要】：真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解途徑主要是溶酶體降解途徑和泛素-蛋白酶體途徑，其中后者通過選擇性清除細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊以及特定環(huán)境下需要降解的蛋白質(zhì)，對維持細(xì)胞正常的生理功能發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其異常與炎癥、癌癥及神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。蛋白泛素化修飾在泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）及泛素連接酶（E3）的順序作用下介導(dǎo)酶促級聯(lián)反應(yīng)完成，最后經(jīng)蛋白酶體降解，其中E3決定底物識別的特異性，是蛋白質(zhì)泛素化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與作用機(jī)制主要分為兩大類：RING鋅指類和HECT結(jié)構(gòu)域類。 RING類E3復(fù)合體APC/C（后期促進(jìn)復(fù)合體）主要在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮功能，它由恒定原件APC2，APC11和其它11個亞基組成。Cdc20和Cdh1是APC/C的激活因子，與底物的特異性相關(guān)，它們通過協(xié)助不同周期進(jìn)程的APC/C復(fù)合體募集底物而維持細(xì)胞周期正常進(jìn)行。其中Cdh1通過識別包含D box或者KEN box的底物在細(xì)胞退出M期的過程中和G1期中發(fā)揮功能。 人們對HECT類E3的功能認(rèn)識主要來自于對Nedd4家族的研究，它們在TGF-β、EGF、IGF、VEGF、SDF-1以及TNF-α等生長因子或細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路中具有重要的調(diào)控作用。NEDL1和NEDL2是Nedd4家族中分子量最大的兩個蛋白，NEDL1與人類神經(jīng)退行性疾病、腫瘤和線蟲對病原體的逃避反應(yīng)等相關(guān)。與NEDL1相比，關(guān)于NEDL2的報道很少，僅發(fā)現(xiàn)NEDL2能夠增強(qiáng)p73的轉(zhuǎn)錄激活能力以及LaminA突變或者敲低可增強(qiáng)NEDL2對細(xì)胞核中ATR激酶的降解。 為了更深入地研究NEDL2的功能，我們通過免疫沉淀/質(zhì)譜鑒定（IP/MS）技術(shù)尋找NEDL2相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)很多候選分子與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)，包括已經(jīng)被報道的周期相關(guān)蛋白PRC1、NUSAP1、PLK1、CENPF、CEP170、CLASP2，APC/C泛素連接酶復(fù)合體的多個亞基，如ANAPC1（APC1）、ANAPC2（APC2）、CDC27（APC3）、ANAPC4（APC4）、ANAPC5（APC5）、CDC16（APC6）、ANAPC7（APC7）、CDC23（APC8）,以及它的激活因子Cdh1。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Cdh1和NEDL2存在相互作用；我們對Cdh1與NEDL2的相互作用及意義進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)NEDL2在M期蛋白水平明顯上升并且與紡錘體共定位，在退出M期時Cdh1能夠通過APC/C促進(jìn)NEDL2泛素化降解；NEDL2適量的水平保證了細(xì)胞周期正常進(jìn)行，通過RNA干擾技術(shù)敲低NEDL2的表達(dá)，將導(dǎo)致細(xì)胞在分裂中期的停留時間明顯延長，而過表達(dá)NEDL2則會導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定，使染色體的分離出現(xiàn)錯誤；染色體分離出現(xiàn)錯誤是腫瘤產(chǎn)生的重要原因，為了驗(yàn)證NEDL2與腫瘤的關(guān)系，我們首先利用免疫組化的方法首次鑒定了NEDL2人組織表達(dá)譜，結(jié)果NEDL2在大腦、腎、腎上腺、肝、睪丸中有較高表達(dá)，在大腸、子宮、肺、胰腺幾個組織中表達(dá)相對較低。我們利用組織芯片檢測了這幾種表達(dá)較低組織的相對應(yīng)腫瘤中NEDL2表達(dá)情況，如結(jié)腸癌、直腸癌、宮頸癌、胰腺癌、肺癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEDL2在結(jié)腸癌和宮頸癌中高表達(dá)。 綜上所述，我們在NEDL2的研究中獲得了眾多新的認(rèn)識。首次揭示了NEDL2在細(xì)胞周期中后期轉(zhuǎn)換調(diào)控中的功能，這不僅對于NEDL2的功能研究是一個突破性的進(jìn)展，同時也發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞中后期轉(zhuǎn)換調(diào)控的新分子。研究也揭示了Cdh1是第一個調(diào)節(jié)NEDL2穩(wěn)定性的重要蛋白。另外，NEDL2與腫瘤的相關(guān)性也是一個全新的認(rèn)識，NEDL2與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的深入研究對于抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的尋找具有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：蛋白質(zhì)泛素化 泛素連接酶 NEDL2 細(xì)胞周期調(diào)控 APC/C-Cdh1
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：Q26
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第1章 緒論11-22
• 1.1 泛素-蛋白酶體降解途徑11-13
• 1.1.1 蛋白質(zhì)降解途徑11
• 1.1.2 泛素蛋白酶體通路11-13
• 1.2 HECT 類泛素連接酶13-18
• 1.2.1 HECT 類泛素連接酶結(jié)構(gòu)與分類14-15
• 1.2.2 NEDD4 家族泛素連接酶結(jié)構(gòu)和功能15-17
• 1.2.3 NEDL1 和 NEDL2 研究現(xiàn)狀17-18
• 1.3 RING 類泛素連接酶18-21
• 1.3.1 SCF 復(fù)合體與 APC/C 復(fù)合體結(jié)構(gòu)18-20
• 1.3.2 APC/C 復(fù)合體、周期調(diào)控與腫瘤20-21
• 1.4 本論文研究目的21-22
• 第2章 材料與方法22-28
• 2.1 材料22
• 2.2 方法22-28
• 第3章 泛素連接酶 NEDL2 相互作用蛋白篩選28-31
• 3.1 NEDL2 酶活中心失活載體構(gòu)建28
• 3.2 IP/MS 篩選及結(jié)果分析28-30
• 3.3 本章小結(jié)30-31
• 第4章 APC/C-Cdh1 在 G1 期中下調(diào) NEDL2 蛋白穩(wěn)定性31-38
• 4.1 Cdh1 與 NEDL2 相互作用驗(yàn)證31
• 4.2 Cdh1 過表達(dá)下調(diào) NEDL2 的蛋白水平31-32
• 4.3 Cdh1 下調(diào) NEDL2 蛋白水平依賴于 APC/C32-33
• 4.4 NEDL2 在 G1，S，G2，M 期蛋白水平檢測33-35
• 4.5 NEDL2 在 M 期到 G1 期過程蛋白水平檢測35
• 4.6 MG132 處理上調(diào)內(nèi)源 NEDL2 蛋白水平35-36
• 4.7 敲低 Cdh1 上調(diào)內(nèi)源 NEDL2 蛋白水平36
• 4.8 本章小結(jié)36-38
• 第5章 NEDL2 參與細(xì)胞周期過程中-后期轉(zhuǎn)換38-43
• 5.1 NEDL2 細(xì)胞定位分析38-39
• 5.2 敲低 NEDL2 引起細(xì)胞周期中期時間明顯延長39-40
• 5.3 過表達(dá) NEDL2 引起染色體不穩(wěn)定40-41
• 5.4 本章小結(jié)41-43
• 第6章 NEDL2 蛋白正常組織及腫瘤組織表達(dá)情況檢測43-45
• 6.1 NEDL2 蛋白水平組織表達(dá)譜43-44
• 6.2 不同腫瘤樣本中 NEDL2 表達(dá)水平檢測44
• 6.3 本章小結(jié)44-45
• 結(jié)論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 附錄 A IP/MS 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-66
• 附錄 B 主要儀器設(shè)備和常用試劑的配制66-69
• 1. 主要儀器設(shè)備66-67
• 2. 常用溶液的配制67-69
• 附錄 C 表達(dá)載體構(gòu)建引物69-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文70
• 已投稿尚未發(fā)表的論文70-71
• 致謝71

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