本文關(guān)鍵詞：基于SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)的Pax4和caspase-6調(diào)控巨噬細(xì)胞替代活化研究

  更多相關(guān)文章： 巨噬細(xì)胞 替代活化 定量蛋白質(zhì)組學(xué) Phagocytosis Pax4 caspase-6

【摘要】：巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,分布于全身各處組織。受到組織微環(huán)境中各種信號刺激后,巨噬細(xì)胞會以不同方式發(fā)生活化,包括以吞噬和殺滅病原體為主要功能的經(jīng)典活化和以免疫調(diào)控與組織修復(fù)為基本特征的替代活化�；罨蟮木奘杉�(xì)胞在機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,并參與調(diào)控各種生理和病理過程。然而,有關(guān)替代活化后巨噬細(xì)胞功能的改變和活化過程中關(guān)鍵調(diào)控分子的研究仍少有報道。本研究利用SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),結(jié)合各種分子生物學(xué)技術(shù)手段對巨噬細(xì)胞替代活化過程細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組和細(xì)胞全蛋白組進(jìn)行定量分析,并基于變化蛋白所提供的信息,揭示了替代活化巨噬細(xì)胞吞噬功能的改變,鑒定了Pax4和caspase-6兩個新的在巨噬細(xì)胞替代活化過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的分子。在我們的研究中,首先利用SILAC蛋白標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記小鼠巨噬細(xì)胞株RAW2647,經(jīng)過5次以上的細(xì)胞傳代后保證輕標(biāo)和重標(biāo)氨基酸均完成各自的摻入過程。標(biāo)記完成之后刺激巨噬細(xì)胞發(fā)生替代活化,其中輕標(biāo)氨基酸摻入的RAW264.7細(xì)胞接受IL-4刺激發(fā)生替代活化,而重標(biāo)氨基酸摻入的RAW264.7細(xì)胞作為對照。利用Biotin-Streptavidin親和富集法分別提取上述兩組細(xì)胞的質(zhì)膜蛋白。等量混合(每種樣品100μg)上述兩種蛋白樣品后,利用FASP方法完成蛋白樣品的還原、烷基化和酶解過程。利用OFFGEL對酶解得到的肽段進(jìn)行分離。分離得到的肽段脫鹽之后進(jìn)入液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜LTQ-Obitrap進(jìn)行質(zhì)譜鑒定并運(yùn)用Maxqaunt軟件處理得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)完成質(zhì)膜蛋白的鑒定和定量過程。最終我們獲得了2238個蛋白的定量信息,其中108個蛋白表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。為了對巨噬細(xì)胞替代活化過程中蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,我們還選取活化過程中5個時間點(diǎn),對巨噬細(xì)胞替代活化過程進(jìn)行動態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。我們?nèi)匀焕肧ILAC蛋白標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記RAW264.7細(xì)胞。標(biāo)記完成之后,經(jīng)過輕標(biāo)氨基酸摻入的RAW264.7細(xì)胞接受IL-4刺激發(fā)生替代活化,在不同的刺激時間點(diǎn)收集蛋白,而重標(biāo)氨基酸摻入的RAW264.7作為對照；分別提取蛋白后,將IL-4刺激不同時間點(diǎn)獲取的輕標(biāo)蛋白分別與不經(jīng)過IL-4刺激的重標(biāo)蛋白(總共200μg,重標(biāo)蛋白作為參照)等量混合進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量實(shí)驗(yàn),共定量3468個蛋白,其中342個蛋白表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。變化蛋白富集分析結(jié)果顯示,吞噬作用通路富集的變化蛋白最多,為22個,且其中19個蛋白發(fā)生下調(diào)表達(dá),表明替代活化巨噬細(xì)胞吞噬作用通路受到損傷。功能試驗(yàn)也證明替代活化巨噬細(xì)胞吞噬能力下降。對于變化蛋白上游調(diào)控分子生物信息學(xué)分析顯示,轉(zhuǎn)錄因子Pax4可能參與調(diào)控巨噬細(xì)胞替代活化過程。基于此,我們首先檢測了巨噬細(xì)胞替代活化過程中Pax4表達(dá)量的變化情況,結(jié)果表明Pax4表達(dá)量上調(diào)顯著。為了進(jìn)一步確認(rèn)Pax4在巨噬細(xì)胞替代活化過程中的功能,我們利用構(gòu)建的Pax4過表達(dá)和shRNA質(zhì)粒,檢測了Pax4表達(dá)量的變化對巨噬細(xì)胞替代活化過程中標(biāo)志分子和細(xì)胞因子表達(dá)的影響,結(jié)果顯示過表達(dá)Pax4可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞替代活化的發(fā)生,而Pax4表達(dá)量受到抑制后巨噬細(xì)胞替代活化過程則受到顯著抑制。既然Pax4可以調(diào)控巨噬細(xì)胞替代活化過程,下一步實(shí)驗(yàn)中我們檢測了Pax4是否同樣是替代活化巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)節(jié)者。我們利用構(gòu)建的Pax4過表達(dá)和shRNA質(zhì)粒,檢測了Pax4表達(dá)量的變化對替代活化巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響,結(jié)果證實(shí)Pax4作為負(fù)向調(diào)控分子參與調(diào)控替代活化巨噬細(xì)胞吞噬功能。隨后的機(jī)制研究表明,Pax4通過轉(zhuǎn)錄激活Bcl-xL的表達(dá)降低了胞漿內(nèi)鈣離子的濃度最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬功能的下降。腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,調(diào)控了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。我們的研究還證實(shí)Pax4同樣是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)分子,并且調(diào)控了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞吞噬能力的下降。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果還證明caspase-6在替代活化過程中上調(diào)表達(dá)顯著�；诖�,我們首先檢測了替代活化巨噬細(xì)胞內(nèi)caspase-6的表達(dá)水平和活性變化,結(jié)果表明caspase-6的表達(dá)量和活性均顯著上升。隨后我們利用caspase-6抑制劑和RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了caspase-6在巨噬細(xì)胞替代活化中的調(diào)控作用,結(jié)果證實(shí)c aspase-6可以調(diào)控替代活化標(biāo)志分子的表達(dá)。利用生物信息學(xué)分析提供的信息,我們還證實(shí)p53作為上游分子參與調(diào)控caspase-6表達(dá)水平和活性的上升。另外,caspase-6同樣是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)分子,并且通過調(diào)節(jié)MMP9的表達(dá)影響了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用。綜上所述,本論文首次利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)描繪了巨噬細(xì)胞替代活化過程質(zhì)膜蛋白質(zhì)組和細(xì)胞全蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜,同時基于變化蛋白提供的線索發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證Pax4和caspase-6作為替代活化巨噬細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)分子分別調(diào)控了巨噬細(xì)胞的吞噬能力和促腫瘤侵襲能力,擴(kuò)展了我們對替代活化巨噬細(xì)胞功能改變和活化過程中關(guān)鍵調(diào)控分子的認(rèn)識。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞 替代活化 定量蛋白質(zhì)組學(xué) Phagocytosis Pax4 caspase-6
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略詞5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 第一章 研究背景12-37
• 1 巨噬細(xì)胞簡介12-17
• 1.1 天然免疫概念12-13
• 1.2 巨噬細(xì)胞13
• 1.3 巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性13-17
• 2 巨噬細(xì)胞活化分子機(jī)制研究進(jìn)展17-28
• 2.1 巨噬細(xì)胞活化的信號通路17-22
• 2.2 巨噬細(xì)胞活化的重要調(diào)控分子22-28
• 3 巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)體生理與病理過程28-32
• 3.1 巨噬細(xì)胞與經(jīng)典炎癥28-29
• 3.2 脂肪組織巨噬細(xì)胞與胰島素耐受29-30
• 3.3 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與腫瘤30-32
• 4 巨噬細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究32-37
• 4.1 經(jīng)典蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在巨噬細(xì)胞功能研究中的應(yīng)用34-35
• 4.2 以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在巨噬細(xì)胞功能研究中的應(yīng)用35-37
• 第二章 Pax4調(diào)控巨噬細(xì)胞替代活化37-80
• 1. 引言37-38
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料與方法38-51
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料38-40
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理40
• 2.3 Q-PCR40-42
• 2.4 精氨酸酶活性測定42-43
• 2.5 ELISA43
• 2.6 流式分析43
• 2.7 細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取43-44
• 2.8 免疫細(xì)胞化學(xué)與激光共聚焦顯微鏡觀察44
• 2.9 細(xì)胞蛋白提取44-45
• 2.10 細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組研究步驟45
• 2.11 溶液中酶解蛋白45-46
• 2.12 肽段分離與質(zhì)譜鑒定46
• 2.13 免疫印跡46-47
• 2.14 細(xì)胞吞噬能力檢測47
• 2.15 Pax4過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建47-48
• 2.16 慢病毒制備48
• 2.17 細(xì)胞核蛋白提取48
• 2.18 EMSA48-49
• 2.19 ATP含量檢測49-50
• 2.20 巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞能力檢測50
• 2.21 原代腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分離50-51
• 2.22 胞漿內(nèi)鈣離子濃度檢測51
• 2.23 數(shù)據(jù)處理51
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-77
• 3.1 替代活化巨噬細(xì)胞模型構(gòu)建51-52
• 3.2 細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取52-55
• 3.3 質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果55-57
• 3.4 動態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果57-58
• 3.5 蛋白組數(shù)據(jù)分析58-59
• 3.6 替代活化巨噬細(xì)胞吞噬功能受到損傷59-62
• 3.7 巨噬細(xì)胞替代活化過程中Pax4表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄活性檢測62-63
• 3.8 P-4調(diào)控巨噬細(xì)胞替代活化過程63-66
• 3.9 P-4調(diào)控替代活化巨噬細(xì)胞的吞噬功能66-71
• 3.10 TAM吞噬功能受到損傷71-72
• 3.11 Pax4調(diào)控TAM的功能表型72-74
• 3.12 Pax4調(diào)控TAM的吞噬功能74-77
• 4. 小結(jié)和討論77-80
• 第三章 caspase-6調(diào)控巨噬細(xì)胞替代活化80-98
• 1 引言80-81
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法81-83
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料81
• 2.2 caspase-6活性檢測81-82
• 2.3 定量蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟82
• 2.4 細(xì)胞蛋白提取和膠內(nèi)酶解82-83
• 2.5 Transwell小室腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)83
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果83-95
• 3.1 巨噬細(xì)胞替代活化模型構(gòu)建83-84
• 3.2 定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果84-87
• 3.3 替代活化過程信號通路變化87
• 3.4 caspase-6表達(dá)水平和活性檢測87-89
• 3.5 caspase-6調(diào)控巨噬細(xì)胞替代活化過程89-91
• 3.6 caspase-6調(diào)控TAM功能表型91-92
• 3.7 caspase-6調(diào)控TAM促腫瘤細(xì)胞侵襲能力92-93
• 3.8 p53調(diào)控巨噬細(xì)胞替代活化過程中caspase-6的表達(dá)和活性93-95
• 4 小結(jié)與討論95-98
• 參考文獻(xiàn)98-107
• 致謝107-109

【共引文獻(xiàn)】

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