發(fā)布時(shí)間：2017-10-16 07:14

  本文關(guān)鍵詞：分子伴侶Trigger Factor新功能位點(diǎn)的鑒定

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【摘要】：分子伴侶廣泛存在于細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物中，在細(xì)胞中組成了龐大健全的網(wǎng)絡(luò)，能夠參與到多種細(xì)胞生理過程中，，例如幫助蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊；參與蛋白復(fù)合體的組裝；參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌等過程。此外，分子伴侶網(wǎng)絡(luò)在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制方面也發(fā)揮著重要的作用，通過對(duì)錯(cuò)誤折疊或者變性蛋白進(jìn)行去折疊和解聚作用，能夠促使其降解。不同分子伴侶之間的相互協(xié)調(diào)共同作用，可以保證細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)處于穩(wěn)定平衡的狀態(tài)。 Trigger Factor (TF)是原核分子伴侶網(wǎng)絡(luò)中的重要成員。TF包含兩部分結(jié)構(gòu)：肽脯氨酰順反異構(gòu)酶（PPIase）結(jié)構(gòu)域和一個(gè)由N-末端和C-末端共同構(gòu)成的裂縫（Crevice）結(jié)構(gòu)。這個(gè)裂縫區(qū)域?yàn)閯倓傠x開核糖體出口位點(diǎn)的多肽提供了保護(hù)空間使其可以正確折疊。TF具有分子伴侶活性的同時(shí)又有折疊酶活性，還能夠調(diào)節(jié)蛋白折疊速度，協(xié)助蛋白質(zhì)翻譯之后的組裝。在TF的作用下，絕大部分蛋白質(zhì)能夠快速高效地完成折疊，這使得TF在協(xié)助新生肽鏈折疊方面具有舉足輕重的作用。 通過對(duì)TF結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行分析，我們?cè)赥F的PPIase結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)兩個(gè)可能與TF分子伴侶功能相關(guān)的疏水區(qū)域，為了確定這兩個(gè)區(qū)域在TF分子伴侶功能中的作用，我們構(gòu)建了兩個(gè)缺失突變體以及四個(gè)位點(diǎn)突變體，即：缺失PPIase結(jié)構(gòu)域的NC、TF389(1-389aa)、I195G、F233G、F322S、L336S/L337G。在利用親合層析及凝膠層系等方法制備得到目的蛋白后，我們使用圓二色譜儀和熒光光譜儀對(duì)TF野生型和突變體蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。然后我們選擇了三種不同分子伴侶活性測(cè)定底物即Lysozyme、BCAII和GAPDH，研究了TF野生型和突變體分子伴侶活性，分析了所選疏水區(qū)域在TF分子伴侶功能中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所選疏水區(qū)域是TF重要的分子伴侶功能位點(diǎn)，其改變能夠引起TF分子伴侶活性發(fā)生顯著性變化。本研究將有助于加深人們對(duì)分子伴侶TF結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)。
【關(guān)鍵詞】：Trigger Factor 分子伴侶 蛋白折疊 蛋白聚集
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 緒論9-18
• 1.1 蛋白質(zhì)折疊和聚集9-10
• 1.2 分子伴侶簡(jiǎn)介10-11
• 1.3 TF 結(jié)構(gòu)和功能11-13
• 1.4 TF 與核糖體及其他分子伴侶相互作用13-15
• 1.5 本文主要研究?jī)?nèi)容及意義15-17
• 1.6 技術(shù)路線圖17-18
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料和方法18-26
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒18
• 2.1.2 主要試劑及試劑盒18-19
• 2.1.3 主要儀器19-20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-25
• 2.2.1 TF-pRSET 重組體的構(gòu)建20-21
• 2.2.2 突變體的制備21-22
• 2.2.3 TF 表達(dá)條件優(yōu)化及大量制備22
• 2.2.4 TF 突變體蛋白的純化及濃度測(cè)定22-23
• 2.2.5 TF 突變體蛋白色氨酸（Trp）熒光光譜和圓二色譜檢測(cè)23
• 2.2.6 TF 突變體蛋白分子伴侶活性檢測(cè)23-25
• 2.2.7 透析袋的處理25
• 2.3 本章小結(jié)25-26
• 第3章 TF 突變體的設(shè)計(jì)制備與表征26-36
• 3.1 TF 突變體設(shè)計(jì)26
• 3.2 TF-pRSET 重組體的構(gòu)建及突變體制備26-29
• 3.3 TF 突變體蛋白的純化29-31
• 3.4 TF 突變體蛋白結(jié)構(gòu)檢測(cè)31-35
• 3.4.1 TF 突變體蛋白 Trp 熒光發(fā)射光譜檢測(cè)32-33
• 3.4.2 TF 突變體蛋白圓二色譜檢測(cè)33-35
• 3.6 本章小結(jié)35-36
• 第4章 TF 突變體蛋白分子伴侶活性研究36-47
• 4.1 TF 突變體蛋白對(duì)變性 Lysozyme 的復(fù)性作用36-39
• 4.1.1 TF 突變體蛋白協(xié)助變性 Lysozyme 重新折疊36-37
• 4.1.2 TF 突變體蛋白對(duì)變性 Lysozyme 聚集的作用37-39
• 4.2 TF 突變體蛋白對(duì)變性 BCAII 的復(fù)性作用39-42
• 4.2.1 TF 突變體蛋白協(xié)助變性 BCAII 重新折疊39-41
• 4.2.2 TF 突變體蛋白對(duì)變性 BCAII 聚集的作用41-42
• 4.3 TF 突變體蛋白對(duì)變性 GAPDH 的復(fù)性作用42-45
• 4.3.1 TF 突變體蛋白協(xié)助變性 GAPDH 重新折疊42-44
• 4.3.2 TF 突變體蛋白對(duì)變性 GAPDH 聚集的作用44-45
• 4.4 本章小結(jié)45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 致謝54

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1041320